α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂后处理对大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用机制的实验研究

摘要

缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是导致急性心肌梗死患者死亡的重要原因。研究发现，心肌缺血-再灌注损伤是由许多矛盾因素相互作用造成的组织损害，其中炎症是最重要的致病因素之一，并且对炎症反应进行适度调控可有效缓解心肌缺血-再灌注损伤。胆碱能抗炎通路（cholinergicanti-inflammatory pathway，CAP）是近年来发现的一种具有免疫炎症反应调节功能的神经生理机制，由迷走神经、神经递质乙酰胆碱和α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)所介导。研究证实，迷走神经电刺激可通过抑制全身和心肌局部炎症反应而明显减轻心肌缺血-再灌注损伤。α7nAChR激动剂同样亦可激活CAP，与迷走神经电刺激相比，其操作简便，临床应用前景好，因此我们选择特异性α7nAChR激动剂PNU282987进行药物干预，观察其对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。
　　线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）是线粒体膜上的一种重要通道性结构，是决定缺血-再灌注损伤时心肌细胞命运的关键点。当心肌发生缺血-再灌注损伤时，MPTP可出现不可逆性高水平开放，通过一系列病理生理学反应最终导致细胞坏死或凋亡。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是一种广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。已经证实多种干预措施的心肌保护效应均与GSK-3β活性抑制有关。核转录因子κB(nuclear transcription factorκB，NF-κB)是炎症反应中的重要成分，可影响多种炎症细胞因子的表达，而GSK-3β可通过影响NF-κB而调控炎症反应。近期研究显示，刺激迷走神经可通过抑制GSK-3β活性而减轻家兔心肌缺血-再灌注后的心肌梗死面积。此外，GSK-3β有利于MPTP的开放，敲除GSK-3β基因可提高MPTP的开放阈值。
　　联合不同干预措施以获得更好的心肌保护效应是心肌缺血-再灌注损伤研究的重要方向，因此本实验采用随机对照的方法，观察α7nAChR激动剂后处理和肢体远隔缺血后处理能否产生协同性心肌保护作用，并观察炎症反应、MPTP，GSK-3β在α7nAChR激动剂后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用α7nAChR激动剂后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用中的地位和相互关系。初步探讨这两种干预措施发挥心肌保护作用的机制。本实验共分为三部分:
　　第1部分 PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理对心肌缺血-再灌注损伤保护效应及其炎症反应抑制作用的实验研究
　　本部分实验旨在比较观察特异性α7nAChR激动剂PNU282987后处理、缺血预处理和肢体远隔缺血后处理对心肌缺血-再灌注损伤及其炎症反应的影响，并观察联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理两种干预措施能否产生更强的心肌保护效应。
　　60只健康雄性SD大鼠建立在体心肌缺血-再灌注损伤模型，随机分成六组（每组10只）:空白对照组（S组）、对照组（C组）、缺血预处理组（IPC组）、PNU282987后处理组（P组）、肢体远隔缺血后处理组（L组）、联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理组（P+L组）。所有大鼠开胸后丝线穿过冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)做成活结。除S组外，所有大鼠均接受局部心肌缺血30 min（阻断LAD）和再灌注120 min（开放LAD）处理。C组无干预措施;IPC组在结扎LAD前实施3个循环缺血预处理，每个循环由5 min LAD阻断和5 min LAD开放组成;P组于再灌注前静脉注射PNU2829872.0mg/kg;L组于心肌缺血20 min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成缺血10 min，并在再灌注前开放后肢血流灌注;P+L组于再灌注前静脉注射PNU2829872.0mg/kg并于心肌缺血20 min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成缺血10 min，在再灌注前开放后肢血流灌注。实验过程中，连续监测心率(heart rate，HR)、平均动脉压(mean arterial presure，MAP)和Ⅱ导联心电图(ECG)。在再灌注120 min时抽取血标本，采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac Troponin-Ⅰ，cTnⅠ)、血清肌酸激酶心肌型同工酶(myocardial-bound creatine kinase，CK-MB)、血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、高迁移率组蛋白1（high mobility group box1 protein，HMGB1）、血清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、血清白介素-10(interleukin-10，IL-10)等浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测心肌梗死面积(infarct size，IS％)。
　　结果显示，各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。
　　与C组相比，IPC组再灌注初期室性心律失常发生率显著降低，室性心律失常评分也显著降低。与C组相比，P组、L组和P+L组的IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度均显著降低;与IPC组相比，P组、L组和P+L组的IS％值和血清cTnⅠ浓度显著增高;与P组和L组相比，P+L组的IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度均显著降低。
　　与S组相比，C组再灌注120 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度显著增高。与C组相比，IPC组、P组、L组和P+L组再灌注120 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度显著降低。与IPC和L组相比，P组和P+L组再灌注120 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度显著降低。
　　第2部分 MPTP功能状态在PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护效应及其炎症反应抑制作用中地位的研究
　　根据第1部分实验结果，我们设计了这部分实验，目的是通过应用MPTP开放剂苍术苷(Atractyloside，ATR)和抑制剂环孢素A(CyclosporinA，CSA)，观察MPTP的开放和抑制对PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护效应的影响，同时观察炎症反应指标，了解心肌缺血-再灌注损伤过程中MPTP功能状态、炎症反应、和心肌保护之间可能的相互联系。
　　120只健康雄性SD大鼠建立在体心肌缺血-再灌注损伤模型，随机分成12组:对照组（C组）;PNU282987后处理组（P组）;肢体远隔缺血后处理组(L组);联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理组（P+L组）;缺血期使用环孢素A的对照组（CSA+C组）;缺血期使用环孢素A的PNU282987后处理组（CSA+P组）;缺血期使用环孢素A的肢体远隔缺血后处理组（CSA+L组）;缺血期使用环孢素A的联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理组（CSA+P+L组）;缺血期使用苍术苷的对照组（ATR+C组）;缺血期使用苍术苷的PNU282987后处理组（ATR+P组）;缺血期使用苍术苷的肢体远隔缺血后处理组(ATR+L组);缺血期使用苍术苷的联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理组（ATR+P+L组）。检测项目同实验第1部分。
　　结果显示与C组相比，P组、L组、P+L组、CSA+C组、CSA+P组、CSA+L组和CSA+P+L组的IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度均明显减小;与CSA+C组相比，CSA+P组、CSA+L组和CSA+P+L组的IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度均明显减小;与CSA+P组和CSA+L组相比，CSA+P+L组的IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度均明显减小;C组、ATR+C组、ATR+P组、ATR+L组和ATR+P+L组五组IS％值、血清cTnⅠ和CK-MB浓度之间比较无显著统计学差异。
　　与C组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在P组、L组、P+L组、CSA+P组、CSA+L组、CSA+P+L组、ATR+P组、ATR+L组和ATR+P+L组显著降低，在CSA+C组无显著统计学差异，在ATR+C组显著升高;与CSA+C组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在CSA+P组、CSA+L组和CSA+P+L组显著降低;与CSA+P组相比，血清TNF-α、IL-6和FMGB1浓度在CSA+L组显著升高，在CSA+P+L组无显著统计学差异;与CSA+L组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在CSA+P+L组显著降低;与ATR+C组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在ATR+P组、ATR+L组和ATR+P+L组显著降低。与ATR+P组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在ATR+L组显著升高，在ATR+P+L组无显著统计学差异。与ATR+L组相比，血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在ATR+P+L组显著降低。
　　第3部分:GSK-3β和炎症反应在PNU282987后处理和肢体远隔远隔缺血后处理心肌保护作用中的地位及其相互关系的研究
　　60只雄性SD大鼠随机分成四组:对照组（C组）;PNU282987后处理组(P组);肢体远隔缺血后处理组（L组）;联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理组（P+L组）。于再灌注120 min时取大鼠左心室缺血区心肌标本。通过线粒体钙离子保留能力（calcium retention capacity，CRC）检测心肌细胞MPTP功能;通过实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chainreaction，RQ-PCR)技术和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)检测凋亡相关基因表达水平和心肌细胞凋亡指数;通过免疫蛋白印迹分析(Western-blot)技术检测GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、NF-κB、p-NF-κB(Ser536)等蛋白的相对表达量。
　　CRC检测结果显示，与C组相比，P组、L组、P+L组缺血区心肌细胞线粒体的CRC明显增加;与P组和L组相比，P+L组CRC明显增加。
　　RQ-PCR结果显示，与C组相比，缺血区心肌Bcl-2 mRNA水平在P组、L组和P+L组明显增高;与P组和L组相比，缺血区心肌Bcl-2 mRNA水平在P+L组明显增高。与C组相比，缺血区心肌Bax mRNA水平在P组、L组和P+L组明显降低;与P组和L组相比，缺血区心肌Bax mRNA水平在P+L组明显降低。TUNEL法细胞凋亡指数检测结果显示，与C组相比，心肌细胞凋亡指数在P组、L组和P+L组明显降低;与P组和L组相比，在P+L组明显降低。
　　Wester-Blot结果显示，与C组相比，缺血区心肌组织p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对灰度值在P组、L组、P+L组显著增高;与P组相比，缺血区心肌组织p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对灰度值在L组显著降低，在P+L组无显著统计学差异;与L组相比，缺血区心肌组织p-GSK-3β(Ser9)蛋白相对灰度值在P+L组显著增高;与C组相比，缺血区心肌组织p-NF-κBp65(Ser536)蛋白相对灰度值在P组、L组和P+L组显著降低;与P组相比，缺血区心肌组织p-NF-κBp65(Ser536)蛋白相对灰度值在L组显著增高，在P+L组无显著统计学差异;与L组相比，缺血区心肌组织p-NF-κBp65(Ser536)蛋白相对灰度值在P+L组显著降低。
　　结论:
　　本实验通过以实验大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤模型的研究表明:
　　1、缺血预处理、PNU282987后处理、肢体远隔缺血后处理均可产生明显的心肌保护作用，但是三种干预措施中缺血预处理减小心肌梗死面积的作用最强，PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理的效果较弱，但是联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理可获得显著增强的心肌保护效果。
　　2、缺血预处理、PNU282987后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理均能明显抑制心肌缺血-再灌注损伤引起的炎症反应，其中PNU282987后处理以及联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理抑制炎症反应的作用最强。
　　3、MPTP抑制剂本身具有心肌保护作用，不影响PNU282987后处理、肢体远隔缺血后处理以及联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护效应和炎症抑制作用。MPTP开放剂则可完全消除PNU282987后处理、肢体远隔缺血后处理以及联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护效应，但不影响三种干预措施的炎症反应抑制作用。
　　4、PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理可通过抑制GSK-3β活性而显著抑制炎症反应和MPTP开放，显著减少心肌细胞凋亡，产生明显的心肌保护作用。联合应用PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理可增强MPTP抑制作用和心肌保护效果。
　　5、PUN282987后处理和肢体远隔缺血后处理可通过抑制GSK-3β活性，相应地抑制NF-κB转录活性，从而抑制炎症反应。两者联合应用的抑制炎症效果与单独应用PUN282987后处理相当，提示PUN282987后处理的心肌保护作用机制中以抗炎作用为主导，而肢体远隔缺血后处理则更依赖其他途径。

目录

摘要

前言

第1部分 PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理对心肌缺血-再灌注损伤保护效应及其炎症反应抑制作用的研究

1．1 在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型的制备

1．2 实验设计背景、分组和方案

1．3 实验检测项目

1．4 数据分析

1．5 实验结果

1．6 结论

第2部分 MPTP功能状态在PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护效应及其炎症反应抑制作用中地位的研究

2．1 实验设计分组

2．2 实验检测项目数据分析

2．3 实验结果

2．4 结论

第3部分：GSK-3β和炎症反应在PNU282987后处理和肢体远隔远隔缺血后处理心肌保护作用中的地位及其相互关系的研究

3．1 实验设计和分组

3．2 PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理对缺血区心肌细胞线粒体Ca2+保留能力的影响

3．3 PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理对缺血区心肌凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达水平的影响

3．4 PNU282987后处理和肢体远隔缺血后处理对缺血区心肌细胞凋亡水平的影响

3．5 PNu282987后处理和肢体远隔缺血后处理对缺血区心肌GSK3β和NF-κBp65活性状态的影响

3．6 数据分析

3．7 实验结果

3．8 结论

讨论

一、关于研究背景和实验设计问题

二、对第1部分实验结果的分析

三、对第2部分实验结果的分析

四、对第3部分实验结果的分析

五、本实验的结果和临床意义

六、本实验研究的不足

七、全文总结

参考文献

文献综述：线粒体通透性转换孔与心肌缺血-再灌注损伤

附录

致谢

个人简历

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