维甲酸导致先天性小耳畸形发病机制研究

摘要

目的:通过观察维甲酸干预后耳廓软骨细胞增殖及基因表达的情况,并比对正常耳廓软骨细胞增殖及基因表达的情况,分析维甲酸对耳廓软骨细胞性状的影响及维甲酸作用的具体分子机制和主要通路,探讨维甲酸导致先天性小耳畸形的发病机制,并进一步通过观察维甲酸对大鼠胚胎发育的影响,为建立维甲酸诱导先天性小耳畸形动物模型积累经验。
　　 方法:
　　 1、取耳廓软骨细胞体外培养,培养液中分别加入不同浓度维甲酸,通过MTT法绘制软骨细胞生长曲线,观察维甲酸对软骨细胞增殖的影响,利用实时荧光定量PCR技术观察维甲酸对软骨细胞相关标志性基因表达的影响,探讨维甲酸对耳廓软骨性状的影响。
　　 2、取耳廓软骨细胞体外培养,对照组正常培养,实验组加入维甲酸,培养48小时后取软骨细胞RNA进行全基因组表达芯片检测,分析维甲酸对软骨细胞全基因组表达的影响,并通过Gene Ontology方法分析维甲酸对软骨细胞作用的靶基因、生物学过程、分子功能、细胞成分等信息。通过Pathway方法构建基于信号通路的基因相互作用网络,探讨维甲酸导致先天性小耳畸形的具体机制,为进一步研究维甲酸导致先天性畸形的分子基础提供依据。
　　 3、通过腹腔注射法在孕13.5天对Wistar孕大鼠应用维甲酸干预,于孕20天剖腹取大鼠胚胎,观察维甲酸对大鼠胚胎发育的影响,为建立维甲酸诱导先天性小耳畸形大鼠模型摸索经验。
　　 结果
　　 1、维甲酸干预可降低耳廓软骨细胞的增殖速度,并且具有时间和剂量依赖性,与正常耳廓软骨细胞相对照,0.5*10-6mol/L浓度维甲酸在第七天,1*10-6mol/L浓度维甲酸在第二天即可降低软骨细胞的增殖速度,研究组与对照组间存在统计学差异。
　　 2、1*10-6mol/L浓度维甲酸干预耳廓软骨细胞48小时后,实时荧光定量PCR检测发现软骨细胞标志物Col2A1的表达降低了53％,Col10A1降低了43％,与软骨细胞性状相关的基因ALP的表达降低了43％,Runx2降低了29％。运用Prizm4统计分析软件进行T-test分析,Col10A1和ALP在处理组的表达相对于对照组具有非常显著的统计学意义(P＜0.0001)。Col2A1和Runx2的表达在处理中也有降低的趋势,但没有统计学意义。
　　 3、相对正常对照,1*10-6mol/L,浓度维甲酸干预耳廓软骨细胞48小时导致多个基因表达改变,差异基因功能集中于细胞增殖、分化、凋亡、迁移及细胞周期等多方面,通过统计及基因功能分析,筛选出多个候选基因:Cyp26A1、Cyp2681、RARRES3、RARRES1、NANOS1、SNAI2、MOP、DAPK—1、SOX4、PLK2、CCNA2、ATP5H等。GO分析和Pathway分析显示维甲酸通过多种通路及途径对耳廓软骨细胞施加影响。对比相关文献发现维甲酸作用具有组织特异性。
　　 4、维甲酸干预可对大鼠胚胎发育产生不良影响,包括发育停滞、死亡及多种先天性畸形,其中存在外耳发育异常。相比胃管灌注法,腹腔注射法所用剂量应适当调整。
　　 结论:
　　 1、维甲酸可抑制耳廓软骨细胞的增殖,其作用具有时间和剂量依赖性,并对软骨细胞性状造成一定的不良影响。
　　 2、维甲酸对耳廓软骨细胞基因表达的影响显示,维甲酸导致先天性小耳畸形的作用机制一是通过干扰多种途径和通路干预外耳发育,二是通过干扰与发育相关的多种基因的表达调控进而影响外耳软骨的发育。
　　 3、维甲酸干预可对大鼠胚胎发育造成多种不良影响,其中包括外耳发育异常,但建立稳定的先天性小耳畸形大鼠模型所需的维甲酸干预的途径、剂量及时机均有待进一步研究。