以PLK1和Pin1为靶点的新型抗肿瘤药物的筛选及分子药理学研究

摘要

细胞周期是细胞生命活动的基本特征，一个完整细胞周期的正常运行受多种细胞周期相关蛋白的严密调控，若该过程失调会导致细胞过度增殖从而引发肿瘤。因此，近年来与肿瘤发生发展密切相关的细胞周期相关蛋白如PLK1-保罗样激酶1(Polo-likekinase1)、Pin1-肽基脯氨酰顺反异构酶(proteininteractionwithNIMA1)已成为研究的主要目标并广泛受到人们的关注。
　　 保罗样激酶1(PLK1)是新近发现的一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要参与细胞周期过程中的中心体成熟、纺锤体形成及染色体分离等过程，对细胞有丝分裂起重要的调控作用。目前已经发现，PLK1在肺癌、宫颈癌、胃癌等多种肿瘤中呈异常高表达，并与某些肿瘤的生物学行为及预后呈负相关。所以，PLK1是肿瘤诊断和治疗非常有意义的靶点。
　　 为了筛选得到更好的PLK1小分子抑制剂，本论文对新合成的一系列咔啉碱类衍生物进行筛选并发现了三个可较好地抑制PLK1活性的化合物DH281、DH285、DH287。体外利用MTT细胞增殖抑制试验、酶联免疫吸附试验、流式细胞分析、虚拟对接、免疫细胞组化等手段来分析这些化合物对PLK1激酶的抑制活性。发现三个化合物DH281、DH285和DH287均可抑制体外纯化的PLK1激酶的活性，且它们的IC50值均较低；能在微摩尔水平下抑制HeLa、HepG2、PC3、MG63等四株肿瘤细胞系的增殖；能显著地诱导HeLa细胞G2/M期和S期细胞阻滞及细胞凋亡。更有趣的是，经这些化合物处理后的HeLa细胞出现了单极纺锤体结构和细胞内Weel蛋白水平上调的情况，此现象是细胞被PLK1抑制剂作用后的典型特征。总之，这些结果证实咔啉碱类化合物DH281、DH285和DH287是新的具有抗肿瘤活性的PLK1抑制剂。
　　 肽基脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl-prolylcis/transisomerase，Pin1)是一类进化上非常保守的肽基脯氨酰异构酶家族成员，能特异性地催化蛋白质中pSer/Thr-Pro基序顺反异构，进而调控多种底物蛋白的功能。研究证实Pin1在多种肿瘤组织中过表达，抑制Pin1的表达和活性，可以抑制肿瘤的增殖，因此鉴于Pin1与肿瘤发生、发展密切的关系，已将其作为肿瘤诊断的标志物。目前，有关Pin1抑制剂的开发正处于临床前研究阶段，虽已有相关活性化合物的报道，但迄今尚未有候选物进入临床试验阶段。
　　 我们以国家新药（微生物）筛选实验室样品库提供的41620个化合物为样品，10μg/mL作为初筛浓度，以酿酒酵母essl蛋白的温度敏感突变型L94P、G127D、A144T、H164R和野生型菌株303-1a作为模式生物进行了筛选。初筛得到三个阳性化合物分别为HWH8-11、HWH8-33、HWH8-36，它们分别在1.0μg/mL、2.5μg/mL和2.5μg/mL时可以抑制突变株的生长而对野生型菌株的生长没有影响。体外Pin1蛋白酶抑制活性测定显示，三个化合物均在微摩水平抑制靶蛋白的活性，且呈浓度依赖性抑制。实验表明，(1)三个化合物均能不同程度地抑制A549、HeLa、MCF-7、PC3、HCT116、MG63和CHO细胞的增殖，IC50值在0.53μM到30.94μM之间。(2)Hochest33342染色法显示，经适当浓度的抑制剂处理48hr后，HeLa细胞呈现典型的凋亡特征如细胞体积明显改变及凋亡小体出现等。(3)采用AnnexinV-PI双染色法，流式细胞仪分析显示与未加抑制剂的阳性对照相比，随着抑制剂浓度的增加凋亡细胞的比例增加，并且随着培养时间的延长凋亡细胞的比例也呈现时间依赖性增加。(4)利用流式细胞仪分析可以测定不同细胞周期的比例，发现三个化合物均能在培养48hr后引起HeLa细胞的G2/M期阻滞，引起CHO细胞的S期阻滞。(5)Western-blotting分析证实三个阳性化合物均能不同程度地降低Pin1下游靶蛋白cyclinD1的含量，且可浓度依赖性地降低cyclinA的含量及增加cyclinE的含量，而并不干扰cdk2的含量。(6)Confocal检测发现经三个阳性化合物处理后含异常中心体的细胞的比例明显下降。总之，上述实验结果证实三个化合物HWH8-11、HWH8-33、HWH8-36是以Pin1为靶点的、并可抑制肿瘤细胞增殖的阳性化合物。
　　 综上所述，本研究以筛选PLK1和Pin1抑制剂为目标，筛选得到多个具有抗肿瘤活性的小分子化合物，并探讨了这些小分子抑制剂在恶性肿瘤细胞相关信号网络中的调控作用与机制，为PLK1和Pin1高表达的恶性肿瘤如宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌等的治疗奠定基础。

目录

声明

英文缩略语

摘要

第一部分 咔啉碱类化合物抑制PLK1的分子药理学研究

前言

1.实验材料

1.1 菌株

1.2 细胞株

1.3 培养基及抗体

1.4 其它试剂及材料

1.5 主要试剂配制

1.6 主要仪器及软件

2.实验方法

2.1 PLK1抑制剂的筛选

2.2 阳性初筛化合物MIC确定

2.3 MTT法检测咔啉碱类化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

2.4 咔啉碱类化合物对PLK1抑制活性测定

2.5 咔啉碱类化合物与PLK1激酶活性位点对接

2.6 阳性化合物DH281、DH285、DH287对HeLa细胞凋亡影响

2.7 流式细胞仪检测阳性化合物对肿瘤细胞周期的影响

2.8 DH281、DH285、DH287对HeLa的纺锤体形成影响

2.9 DH281、DH285、DH287对HeLa的Weel蛋白含量影响

3.结果

3.1 咔啉碱类化合物在酿酒酵母上的活性测定

3.2 18个咔啉碱类化合物对肿瘤细胞增殖抑制活性

3.3 18个咔啉碱类化合物对PLK1的体外抑制活性

3.4 18个咔啉碱类化合物与PLK1蛋白的激酶结构域的虚拟对接

3.5 DH281、DH285、DH287诱导HeLa细胞凋亡

3.6 DH281、DH285、DH287诱导HeLa细胞周期阻滞

3.7 DH281、DH285、DH287诱导单极纺锤体形成

3.8 DH281、DH285、DH287诱导Weel蛋白表达量增加

4.讨论

第二部分 以Pin1为靶点抗肿瘤药物的筛选和活性验证

前言

1.实验材料

1.1 菌株

1.2 细胞株

1.3 培养基

1.4 试剂盒及主要试剂

1.5 主要试剂配制

1.6 主要仪器及软件

2.实验方法

2.1 温敏突变株模型上抑制剂的筛选

2.2 初筛阳性化合物MIC的确定

2.3 Pin1的表达及纯化

2.4 Pin1抑制剂筛选体系的建立

2.5 MTT法检测阳性化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

2.6 AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡

2.7 Hoechst33342染色法检测阳性化合物对HeLa细胞凋亡的影响

2.8 流式细胞仪检测阳性化合物对肿瘤细胞周期的影响

2.9 Western-blotting检测阳性化合物对相关信号通路的影响

2.10 激光共聚焦检测纺锤体形态变化

2.11 阳性化合物与Pin1活性对接

3.实验结果

3.1 酵母ess1与人类Pin1序列比对

3.2 酵酒酵母模型筛选结果

3.3 阳性化合物的MIC的测定

3.4 Pin1-pET-30a的构建及鉴定

3.5 阳性化合物对Pin1抑制活性的测定

3.6 阳性化合物对不同肿瘤细胞系增殖抑制测定

3.7 阳性化合物对HeLa细胞凋亡的影响

3.8 Hoechst33342检测阳性化合物对HeLa细胞凋亡的影响

3.9 阳性化合物对HeLa细胞周期的影响

3.10 Western-blotting检测阳性化合物对相关信号通路的影响

3.11 阳性化合物可以干扰中心体的形成

3.12 阳性化合物虚拟对接

4.讨论

5.结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

攻读学位期间获得学术成果