恶性疟多表位疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌中的表达纯化及稳定溶液体系的筛选

摘要

疟疾是当今世界上对人类危害最严重的三大传染性疾病之一，主要流行于热带和亚热带地区。根据WHO最新统计数据估计，仅2010年全世界就有2.16亿疟疾临床病例，大约65.5万人因其而死亡，2010年全球有33亿人面临感染疟疾的风险，而且人多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下儿童和孕妇。在感染人的5种疟原虫中，恶性疟原虫是危害最严重、致死率最高的一种。近年来，尽管在疟疾控制方面取得了显著成效，但南于抗药性恶性疟原虫虫株和抗杀虫剂蚊媒的产生及蔓延，使得传统疟疾防治方法受到严峻挑战，这就加剧了人们对于预防性和治疗性疟疾疫苗的需求。由于疟原虫生活史复杂，抗原表达具有期特异性、虫株间差异性、虫体间的高度变异性和逃避宿主免疫攻击的机制等特点，基于单个抗原或表位的疫苗在相关实验中的免疫效果并不理想。因此，多期多价人工疫苗成为目前抗疟疫苗的研究热点。
　　 本课题组对恶性疟原虫多表位疫苗的研制进行了长期的探索，前期利用表位改组技术构建了多表位基因库，并用库免疫血清筛选出了免疫原性最佳、稳定性最好的随机组合多表位人工抗原M.RCAg-1，最终获得了原核表达的高效工程菌。M.RCAg-1与佐剂乳化后免疫小鼠和新西兰大白兔，结果显示其具有较强的免疫原性，特异性抗体在体外可抑制疟原虫生长(GrowthInhibitionAssay,GIA)。表明M.RCAg-1可作为恶性疟原虫红内期候选疫苗，进一步优化、开发。但是，由于初步放大生产所获得的重组蛋白量较低，而且其在-80℃保存几周后会出现降解或聚集，给后续研究带来了困难。因此，获得高纯度稳定的M.RCAg-1重组蛋白是临床前研究的关键步骤。
　　 本研究在前期工作的基础上，根据多表位嵌合抗原疫苗M.RCAg-1的理化性质，利用镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等不同组合方式的5种纯化方案对其进行纯化，根据最终纯度和回收率选择最佳纯化方案，摸索出了多表位嵌合抗原疫苗M.RCAg-1的纯化步骤。与此同时，选用了蛋白结晶试剂盒CrystalScreenHT(HR2-130)中的溶液与M.RCAg-1蛋白液混合，通过倒置显微镜观察和12％SDS-PAGE电泳图谱，筛选出了最适合M.RCAg-1的溶液体系。此外，鉴于二硫键在蛋白质的正确折叠、高级结构的形成以及保持其生物活性等方面都起着重要作用，本文也对M.RCAg-1的二硫键定位进行了初步分析。
　　 本研究主要取得以下进展：
　　 1．在大肠杆菌中可溶性表达M.RCAg-1，表达量达到20%以上。
　　 2．摸索出纯化多表位嵌合抗原疫苗M.RCAg-1的最佳步骤，为下游放大生产和进一步研究M.RCAg-1的免疫效果奠定了基础。在1L培养基中平均获得206.68mg菌体总蛋白，目的蛋白M.RCAg-1约占菌体总蛋白的20.92%，最终纯化结果显示目的蛋白纯度大于99%，回收率大于15%。
　　 3．利用蛋白结晶试剂盒CrystalScreenHT(HR2-130)，筛选出了使M.RCAg-1稳定的溶液体系。经研究证实M.RCAg-1溶解于PBS后可在-80℃保存六个月以上不发生降解。
　　 4．对M.RCAg-1重组蛋白进行二硫键定位分析。初步分析结果显示，M.RCAg-1分子中Cys215-Cys329形成二硫键，Cys215-Cys215形成链间二硫键。

目录

前言

实验材料

实验方法

实验流程图

实验结果

第一部分:恶性疟原虫随机重组多表位疫苗M.RCAg-1的表达纯化

第二部分:M.RCAg-1稳定溶液体系的筛选

第三部分 M.RCAg-1的冻干及复溶性和稳定性检测

第四部分 M.RCAg-1的分子量测定及二硫键预测

讨论

小结

参考文献

综述

附录

致谢

个人简历

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