肿瘤相关巨噬细胞与淋巴瘤细胞相互作用及雷利度胺作用机制研究

摘要

研究背景:
　　肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophage，TAM)是肿瘤微环境的重要组成部分，其具有极强的可塑性和异质性，在肿瘤的发生、进展、转移等过程中起到重要作用。近年来大量研究发现，TAM的大量浸润与多种血液系统恶性肿瘤的不良预后相关。对于肿瘤微环境中TAM的形成机制、表型转换及其对肿瘤生长作用的探索，将为今后针对TAM的免疫治疗和靶向治疗供理论依据和支持。
　　研究目的:
　　1、探索体外条件下，淋巴瘤细胞对于外周血来源的单核细胞向TAM分化的影响及TAM对淋巴瘤细胞生长的作用。对比患者及健康志愿者在以上方面有无差别。
　　2、研究雷利度胺在肿瘤微环境中对于单核细胞向TAM分化的影响及其在肿瘤微环境中的作用。对比以上作用在患者及健康志愿者有无差别。
　　研究方法:
　　本研究共纳入19名初治淋巴瘤患者及8名健康志愿者。在体外条件下，利用Transwell嵌套构建外周血单核细胞与淋巴瘤细胞株HUT-78的共培养模型。通过流式细胞技术分析TAM特征性表型CD68、CD163的表达情况来研究淋巴瘤细胞对于单核细胞向TAM分化的作用。同时，从淋巴瘤细胞的生长曲线、细胞因子IL-10、VEGF的分泌、信号转导和转录活化因子3(STAT3)表达激活几个方面进一步研究分化而来的TAM对于肿瘤细胞及共培养体系的影响。对比初治淋巴瘤患者和健康志愿者在以上几方面有无差别。
　　构建PBMC与淋巴瘤细胞共培养模型以模拟肿瘤微环境，采用同上的研究方法探索雷利度胺在此共培养体系中对于单核细胞向TAM分化的影响，对比患者和健康志愿者有无差别。
　　研究结果:
　　1、患者及健康志愿者的单核细胞与淋巴瘤细胞共培养后CD68、CD163、CD68&CD163(+)细胞的比例显著升高，患者及健康志愿者升高程度无显著差异。
　　2、患者及健康志愿者的单核细胞及其分化而来的巨噬细胞在体外培养条件下对淋巴瘤细胞的生长无直接的促进或抑制作用。
　　3、患者共培养组IL-10、VEGF水平明显低于单核细胞和淋巴瘤细胞单独培养组之和(P＜0.01)，健康志愿者无此现象。
　　4、患者共培养组淋巴瘤细胞相对于单独培养组其STAT3基因的表达量略有下降趋势，但无统计学差异。对比患者与健康志愿者共培养组STAT3基因的相对表达量，健康志愿者组明显高于患者组(P＜0.05)。
　　5、对于患者组，在PBMC与HUT-78构成的共培养体系中加入雷利度胺后CD68、CD163、CD68&CD163(+)细胞比例及CD68&CD163(+)在CD68(+)细胞中所占比例均有极其显著的下降(P＜0.01)。而对于健康志愿者组，CD68、CD163、CD68&CD163(+)细胞比例均有显著下降(P＜0.05)，而CD68&CD163(+)在CD68(+)中所占比例无显著下降(p=0.114)。
　　6、在患者组，加入雷利度胺的共培养组相对于未加雷利度胺的共培养组IL-10、VEGF浓度均有显著下降(IL-10P=0.003，VEGFP=0.018)，TGF-β1均值略有下降趋势，但无统计学意义。在健康志愿者组，加入雷利度胺的共培养组相对于未加雷利度胺的共培养组IL-10浓度有显著下降(P＜0.05)，但程度弱于患者，VEGF、TGF-β1无显著下降趋势。
　　7、患者组共培养体系加入雷利度胺后淋巴瘤细胞STAT3基因的表达量有下降趋势，但无显著统计学意义。而健康对照组加入雷利度胺对于共培养体系中淋巴瘤细胞STAT3基因的表达无促进或抑制趋势。
　　研究结论:
　　1、体外条件下，淋巴瘤细胞能够促进外周血单核细胞向M2型巨噬细胞分化。在淋巴瘤细胞对分化的促进程度上，患者及健康志愿者无显著差异。
　　2、患者单核细胞转化而来的TAM在体外共培养体系中的整体作用类似M1型巨噬细胞，能够有效抑制共培养体系中总IL-10、VEGF的分泌，对淋巴瘤细胞STAT3的表达无明显激活。而健康对照组的TAM对体系中IL-10及VEGF的分泌无明显影响，与其共培养的淋巴瘤细胞STAT3的表达明显高于患者组。
　　3、对于患者，雷利度胺在PBMC与淋巴瘤细胞构建的体外共培养体系中能够有效抑制单核细胞向M2型巨噬细胞的分化。而对于健康志愿者，雷利度胺仅能够抑制单核细胞向巨噬细胞总体的分化，但并不能显著降低其分化为M2型巨噬细胞的比例。
　　4、对于患者，雷利度胺对共培养体系中IL-10、VEGF、TGF-β1的分泌及淋巴瘤细胞STAT3基因的表达均呈现一定程度的抑制作用。而对于健康志愿者，无以上抑制作用或作用程度明显弱于患者。

目录

摘要

前言

第一部分 单核细胞系THP-1的TAM转化效应及其对淋巴瘤细胞生长作用研究

引言

材料与方法

一、实验用细胞系

二、细胞培养条件

三、实验试剂、耗材及仪器

四、实验步骤

五、统计学处理

实验结果

一、淋巴瘤细胞对单核细胞向TAM分化的影响

二、TAM对淋巴瘤细胞株HUT-78生长的影响

讨论

结论

第二部分 体外条件下外周血单核细胞的TAM转化效应及TAM对淋巴瘤细胞生长作用研究

引言

材料及方法

一、研究对象

二、临床资料的收集

三、诊断方法及诊断标准

四、实验试剂及仪器

五、实验步骤

六、统计学处理

实验结果

一、临床资料

二、淋巴瘤细胞对单核细胞向TAM分化的影响—流式细胞技术检测TAM特征性标志物

三、TAM对淋巴瘤细胞生长的作用——绘制淋巴瘤细胞生长曲线

四、ELISA法检测各组细胞培养上清IL-10及VEGF分泌水平

五、实时荧光定量PCR法检测各培养组HUT-78细胞STAT3基因的表达水平

讨论

结论

第三部分 雷利度胺对单核细胞向TAM分化的影响及其在共培养体系中作用研究

引言

材料及方法

一、研究对象

二、临床资料的收集

三、诊断方法及诊断标准

四、实验试剂及仪器

五、实验步骤

六、统计学处理

实验结果

一、雷利度胺对单核细胞向TAM分化的影响

二、ELISA法检测各组细胞培养上清IL-10、VEGF、TGF-β1分泌水平

三、实时荧光定量PCR法检测各培养组HUT-78淋巴瘤细胞STAT3基因的表达水平

讨论

结论

参考文献

致谢

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