人源HIV-1广谱中的Fab抗体的鉴定

摘要

中和抗体的产生是机体针对病毒感染的主要免疫应答，同时也是设计研发有效疫苗的基础。就HIV-1而言，中和抗体在机体对抗病毒感染中起着尤其重要的作用，诱导机体产生有效的中和抗体也是疫苗免疫反应的一个重要组成部分。在遏制HIV-1感染的疫苗设计中，一个关键目标是通过疫苗免疫能够诱导机体产生中和不同HIV-1毒株的广谱中和抗体。因此，分离和鉴定具有广谱中和活性的抗体，在抗HIV-1感染的研究中正得到越来越多的关注。
　　 然而，HIV-1在长期的进化中产生出许多拮抗机体免疫应答的方法，从而逃避机体免疫系统的抗病毒反应。这就使得机体在感染HIV-1时，产生的中和抗体往往中和病毒的活性弱，而且这些抗体只能中和某种特定亚型的病毒。
　　 迄今为止，只有为数不多的中和抗体具有广谱交叉中和活性，包括2F5、4E10、2G12、b12、VRC01、PG9、PG16、X5、17b等。最近，一个新的针对HIV-1 gp41膜邻接区域(membrane-proximal external region，MPER)靶位的强有效的广谱中和抗体10E8被发现，它是继2F5、4E10后另外一个针对此区域的中和抗体。相比较于2F5、4E10局限的中和反应谱，10E8可以中和接近98％的病毒。这也使它成为目前拥有最为广谱中和活性的抗体。
　　 HIV-1广泛的基因变异、快速的增殖、频繁的重组使其成为自然界进化最快的、拥有最为复杂的进化分枝及亚型的微生物之一，而且这一特点在中国艾滋病流行中表现的尤为突出。HIV-1在中国的流行病株主要包括三个亚型:CRF01_AE、B'和C/CRF07_BC/CRF08_BC/B'C(C/07/08/BC)。目前已知的广谱中和抗体对中国流行毒株的中和活性并不理想，其中包括最近才发现的对90％ HIV-1具有中和活性的VRC01，这无疑给针对中国流行株的疫苗研发带来了更大的挑战。此外，美国、南非、欧洲、肯尼亚以及印度HIV-1感染者血清中和抗体的研究为全世界艾滋病疫苗的研制提供了重要的参考信息。然而，针对中国HIV-1感染者血清中和抗体反应的研究非常薄弱。最近，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心报道了国内103例HIV-1 B'亚型感染者血清针对25株不同亚型HIV-1假病毒的中和反应，其中包括主要的中国流行株CRF07_BC、CRF01_AE等亚型。这些被列入研究的感染者没有接受过抗病毒药物治疗并且长期携带病毒超过10年未发病，即艾滋病精英控制者(elite controllers)。研究发现，29％（30例）的血清能够中和80％的检测病毒，其中血清样本F524能够中和全部25株病毒，这提示具有中和活性的感染者血清内可能存在广谱的中和抗体，也为设计研发针对中国流行株的艾滋病疫苗带来了新的希望。因此，本实验室试图从F524感染者中分离具有广谱中和活性的抗体，力图通过对新抗体进行深入研究，为开发有效的HIV疫苗奠定理论基础。我们前期的工作利用F524感染者的外周血单个核淋巴细胞(PBMC)标本构建了噬菌体展示抗体库，并通过交叉利用来源于A和C亚型HIV-1的三聚体形式包膜蛋白富集筛选的方法，成功分离得到一个新的具有广谱反应活性的单克隆Fab抗体A16。本课题聚焦于研究A16的广谱中和活性、中和机制和抗原识别表位。通过基于假病毒中和实验的方法对A16抗体的中和活性做了鉴定，利用受体结合阻断实验和抗体竞争实验对A16的中和机制进行了初步分析，同时利用噬菌体随机肽库结合生物信息学方法预测并确定了抗体所识别的表位，对抗体的中和机制进行了解释。研究发现，A16能够中和包括A，B，C，B'，CRF AG，CRF07 BC和CRF01 AE等亚型在内的多株HIV毒株。有意义的是，A16针对中国流行株有着更好的中和活性，能够中和HIV-1中国流行株BC和B'亚群中对另两个针对CD4结合区的广谱中和抗体b12和VRC01抵抗的多株病毒。通过对A16抗原表位的研究发现，A16识别位于gp120的CD4结合区的保守位点:主要由loop D区，β20-21发夹结构的N425，及W96，I109，R480位点组成。其表位有别于另外两个同样针对该区域的广谱中和抗体VRC01及b12。推测A16主要通过与病毒竞争受体CD4的结合，进而发挥其广谱的中和活性。A16另一突出的特点是，其重链和轻链可变区(VH和VL)都具有相对较长的CDR3序列和较低的体细胞突变率。
　　 综上所述，A16抗体能够广谱并且有效地中和不同HIV-1亚型的代表毒株，尤其是在中国流行的BC和B'亚型，其中一些毒株难于被其他一些广谱中和抗体中和，提示A16可能可以与这些抗体联合使用，用于治疗HIV-1感染。另外，我们的研究结果表明，A16识别的位于CD4结合区loop D为主的表位能够被机体免疫系统识别并且产生具有广谱活性的抗体。本研究可能为开发有效的诱导机体产生广谱中和抗体的疫苗提供线索。

目录

图表

摘要

引言

(一)HIV的分子生物学特征

(二)HIV主要的致病机制

(三)机体对HIV感染的免疫反应

(四)HIV广谱中和抗体研究现状及意义

实验材料与方法

(一)主要试剂与实验材料

(二)主要仪器设备

(三)实验方法

1．Fab形式抗体A16的表达及纯化

2．ELISA检测A16交叉反应活性

3．A16与去构象HIV-1 gp120的结合反应(gp120 reduction ELISA)

4．竞争ELISA(Competition ELISA)

5．HIV-1假病毒的制备

6．基于HIV-1假病毒的中和实验

7．噬菌体表面展示肽库筛选A16所识别的模拟肽

8．预测A16所识别的表位

9．点突变分析对预测的A16结合位点进行验证

10．A16所识别表位的结构展示及分析

实验结果

(一)Fab形式抗体A16的亲和纯化

(二)抗体A16反应活性的鉴定

(三)抗体A16具有广谱的中和活性

(四)抗体A16识别位于gp120上的CD4结合区域的构象表位

(五)抗体A16、b12、VRC01对中国HIV-1主要流行毒株中和活性的比较

(六)对抗体A16所识别的表位进行鉴定

(七)A16表位与抗体b12及VRC01表位的比较

(八)抗体A16可变区(V区)基因序列分析结果

结果分析与讨论

小结

参考文献

综述

附录

致谢

声明