人源Fab噬菌体抗体库的构建及Amylin抗体的筛选与鉴定

摘要

背景和目的:胰淀素是胰岛β细胞分泌的一种激素，与胰岛素共同贮存于胰岛β细胞的分泌囊泡中，二者在葡萄糖及非糖激素刺激下以一定比例相伴释放到胰岛β细胞外。现已发现它是一个多效激素，以多重角色参与了机体的物质及能量代谢过程。目前研究也表明胰淀素代谢异常可形成胰淀素聚集体，它是胰岛淀粉样蛋白变性纤维形成过程中的早期中间产物，参与了破坏胰岛细胞双层脂质膜，最终导致胰岛细胞凋亡的过程。因此其与2型糖尿病的关系受到越来越多的关注，但是胰淀素的确切生物学功能目前尚不完全清楚。由于胰淀素的分子量小、体内含量低，给检测其水平带来了困难。用传统制备抗体的方法，如杂交瘤技术和抗原免疫的方法得到的抗体少，且工作繁琐，周期较长，制备出来的抗体缺乏稳定性和特异性，给研究胰淀素在体内的变化规律带来了阻力。因此如何简便、快速地制备胰淀素高纯度的抗体是开展进一步研究的重要环节。
　　噬菌体抗体库技术的出现为人源抗体的制备开辟了新的途径，使得筛选潜在的人抗体片段成为可能性，较好的解决了抗体难制备的问题。它是用基因工程的方法制备人源化抗体，是一种能从各种各样的文库中筛选高质量人源性抗体的稳定而简便的技术。这种技术不经免疫，绕过杂交瘤技术，直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体，较好地解决了人杂交瘤技术低效及人体排异反应的难题。本研究采用噬菌体表面展示技术在本室构建的抗体库[1]的基础上进行了引物及载体的改良，重新构建了一个库容量更大、多样性更好的人源Fab噬菌体抗体库，建立了人源抗体制备技术平台，用于制备人源化的胰淀素抗体，为下一步进行抗体的表达、纯化、大量制备以及进一步的临床应用研究提供可行的方法。
　　方法:从正常健康人的外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，以逆转录PCR(RT-PCR)法扩增人抗体重链Fd段和轻链基因。轻链PCR产物和噬菌粒载体pComb3XSS分别经SacⅠ/XbaⅠ双酶切，由T4 DNA连接酶连接，电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，扩增后提取噬菌粒，构建轻链库。轻链库噬菌粒DNA和重链Fd段PCR产物经XhoⅠ/SpeⅠ双酶切，以同样方法连接后转化XL1-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13，构建噬菌体抗体库。随机挑取10个克隆酶切鉴定有无插入片段;并以提取的噬菌体抗体库噬粒DNA为模板，以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。以胰淀素为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选。Phage-ELISA鉴定胰淀素特异性噬菌体抗体并选取阳性克隆测定轻链、重链(Fd)DNA序列并进行同源性分析。
　　结果:最终构建的抗体库库容达0.8×108 pfu/ml，重组率为70％，酶切和PCR显示有插入片段。以胰淀素为抗原对抗体库进行3轮筛选，抗体库滴度增加了约22倍，说明携带抗胰淀素抗体的特异性噬菌体得到了明显富集。Phage-ELISA法测定其抗原结合活性，其中一个阳性克隆经DNA测序分析，结果显示与胰淀素特异结合的噬菌体抗体的重链核苷酸序列与人免疫球蛋白γ链同源性为88％，轻链核苷酸序列与λ链同源性为93％。
　　结论:成功构建了一个人源Fab噬菌体抗体库，为今后筛选制备各种抗体提供了技术平台。成功获得胰淀素人源Fab抗体，为胰淀素Fab抗体的表达、纯化和大量制备，进而为研究该激素的生理和病生理作用做好了物质准备。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、人源Fab噬菌体抗体库的构建及鉴定

1．1 材料和方法

1．1．1 材料

1．1．2 主要仪器

1．1．3 实验流程

1．1．4 方法

1．2 结果

1．2．1 外周血淋巴细胞总RNA的提取

1．2．2 重链Fd段和轻链基因的PCR扩增结果

1．2．3 噬粒pComb3XSS的鉴定

1．2．4 轻链库的构建及鉴定

1．2．5 辅助噬菌体VCSMl 3的扩增和滴度测定

1．2．6 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定

1．2．7 Fab噬菌体抗体库的库容滴定

1．2．8 噬菌体抗体库的初步筛选

1．3 讨论

1．3．1 抗体库的种类

1．3．2 制约抗体库质量的因素

1．3．3 构建抗体库所用的噬菌粒载体

1．3．4 噬菌体抗体库技术待解决的问题

1．4 小结

二、胰淀素人源Fab抗体的筛选和鉴定

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验流程

2．1．4 方法

2．2 结果

2．2．1 胰淀素特异性抗体的富集和筛选

2．2．2 抗原结合活性的ELISA检测

2．2．3 测序结果

2．3 讨论

2．3．1 噬菌体抗体库亲和筛选过程中的问题

2．3．2 阳性克隆的鉴定

2．3．3 高亲和力抗体的获得

2．4 小结

结论

问题与展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 噬菌体抗体库技术研究进展

致谢