人骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞过程中microRNA作用机制研究

摘要

S100蛋白家族是一个钙结合蛋白家族，该家族具有多种重要的生理功能，研究发现S100蛋白在多种肿瘤中存在表达差异并且与肿瘤的发生发展关系密切。S100A14是2002年发现的S100家族的新成员，关于其在肿瘤发生发展中的功能性角色知之甚少。我们前期工作发现SIOOA14在食管癌中表达下调且与淋巴结转移正相关，分子机制研究表明S1OOA14以p53依赖的方式参与对MMP2的调节进而促进细胞侵袭;胞外的S100A14蛋白可与RAGE结合激活MAPK和NF-κB通路调节细胞增殖。为了进一步明确S1OOA14在乳腺癌中的表达差异，研究S1OOA14与乳腺癌临床病理参数之间的关系，我们通过免疫组织化学方法在蛋白水平研究了其在乳腺癌中的表达变化，发现S1OOA14在乳腺癌中表达升高并且S100A14的表达与HER2的表达密切相关(r=0.425，P＜0.001)。另外我们发现在多数乳腺癌组织中S100A14与HER2都集中在细胞膜上表达，两者存在共定位。随后我们在乳腺癌细胞系BT474及SK-BR-3中进行了验证。结合以上结果我们推测S100A14与HER2可能存在相互作用。Pull-down及Co-IP实验结果证实了我们的推测:即S100A14与HER2存在相互作用。进一步研究表明SIOOA14与HER2胞内区存在相互作用。为了进一步确定两者的结合部位，我们分别构建了截短的HER2胞内区及S1OOA14的表达质粒，Co-IP实验结果表明HER2胞内区956-1154aa与S1OOA14C端EF手相结构对两者的结合至关重要。
　　 为了进一步研究S100A14在乳腺癌中的功能，我们通过siRNA干扰的方法在MCF-7细胞中敲减S100A14然后过表达HER2，Westem Blot检测HER2下游信号分子的变化，结果发现敲降S100A14可以至少部分阻止ERK及AKT的激活。细胞增殖实验表明HER2诱导的细胞增殖可以被S1OOA14敲降抑制，在S100A14敲降的MCF-7细胞中过表达HER2，细胞增殖与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 S1OO家族的多个成员可分泌至血清中，目前已有包括S1OOA4、S1OOA8、S1OOA9在内的多种S100作为肿瘤诊断和预后的血清学肿瘤标记物。我们前期研究表明S1OOA14可分泌至肿瘤细胞培养的上清中，胞外的S1OOA14蛋白具有重要的功能,我们在125例乳腺癌患者、75例健康人群及44例乳腺良性疾病患者（包括30例良性肿瘤患者和14例乳腺腺病患者）血清中检测SlOOA14蛋白的水平。ELISA结果表明乳腺癌患者血清中的S1OOA14水平显著高于良性患者及健康人群血清中水平(P＜0.001)。
　　 综上，S100A14可能通过结合HER2并影响HER2信号通路在乳腺癌发生发展过程中发挥一定的功能。本研究将增加人们对S1OOA14在信号转导中作用的认识，为阐明其在乳腺癌进展中的作用机理提供证据。

目录

摘要

前言

材料

第一部分 人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞方法的建立

实验方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 microRNA在软骨细胞分化过程中的表达

实验方法

实验结果

讨论

结论

第三部分 靶基因为RUNX3的microRNA的预测及验证

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢

个人简历

声明