DEC-205靶向抗体的制备及其人源化改造

摘要

单克隆抗体在生物制药领域有着广泛的应用。单克隆抗体不仅自身能够作为免疫调节分子应用于一些免疫系统紊乱性疾病，也可以作为靶向性载体将药物特异性地传输至目标靶点。DEC-205作为树突状细胞(Dentritic cells，DC)表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)，能够特异性的捕获抗原分子，加工递呈给机体免疫系统，诱导免疫反应。抗DEC-205单克隆抗体能够有效的增强这一过程。体外实验表明，经过DEC-205靶向抗体辅助的抗原递呈效率能够增强1000倍。DEC-205单克隆抗体做为载体在慢性感染性疾病及癌症等的免疫治疗中有巨大的应用前景。
　　 我们通过免疫大鼠进行细胞融合的方法得到一株抗人DEC-205分子的单克隆抗体1-17-2。经过抗体亚型分析，鉴定该抗体为大鼠IgG1、Kappa亚型。该抗体能够识别人树突状细胞表面DEC-205分子，并诱导DC细胞对抗体的内吞效应。我们通过ImageStream仪器检测到1-17-2抗体一旦与DC细胞结合，会引起DC细胞的内吞现象。该抗体作为载体能够应用于各种慢性感染性疾病及癌症等的免疫治疗中。然而该抗体作为鼠源抗体，要想作为治疗性药物作用于人体，必须经过人源化改造。
　　 抗体人源化改造的方法有很多种，基本分为基于理性化设计和基于经验的两类方法。CDR graft属于基于理性化设计类的方法，是抗体进行人源化改造最基本的方法。CDR graft的基本原理是将抗体的CDR(complementarity determining regions)移植到作为模板的人源抗体的FR(Frame region)中，即保证了抗体的结合特异性又将非人源氨基酸进行了替换。然而，CDR graft之后会导致抗体的亲和力下降。在CDR graft进行人源化改造过程中，有两个关键的因素决定了抗体的亲和力。第一个是人源化模板的选择。第二个是选择FR中关键位点氨基酸进行回复突变。这两个因素也是导致目前抗体人源化改造比较困难的主要原因。
　　 在本研究中，我们设计出一种基于表位扫描和分子动力学模拟的抗体人源化改造方法对1-17-2抗体进行人源化改造。我们首先通过同源建模(Homology modeling)和分子动力学模拟(Molecular dynamics，MD)的方法构建并优化1-17-2抗体Fab区域的三维结构。通过表位扫描算法对1-17-2 FR进行扫描，将大鼠特异性氨基酸位点进行人源化替换。在1-17-2中共找到30个人源化替换位点。然而人源化替换后的抗体CDR构象发生了较大的变化，抗体的亲和力也有一定程度的损失。因此，我们进一步利用虚拟突变和MD模拟，动态评估FR中30个突变位点对CDRs构象的影响。经过评估，找到5个关键氨基酸位点，回复突变这些关键氨基酸位点可以使抗体的亲和力得到进一步的恢复。
　　 我们通过实验验证了回复突变后的抗体亲和力的恢复。按照人源化抗体的设计和优化计算结果，构建出嵌合抗体、人源化抗体和优化抗体的表达载体，体外表达出三种抗体。通过表面质子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)实验测定出抗体的亲和力。实验结果显示，人源化抗体的亲和力比嵌合抗体下降了很多，优化抗体的亲和力恢复到与嵌合抗体一致的水平。
　　 通过荧光共聚焦显微镜及流式检测实验证明，1-17-2亲本抗体和进行优化后的人源化抗体都能够诱导DC细胞的内吞现象。因此，我们制备的抗人DEC-205抗体具备作为治疗性疫苗载体的潜在价值。
　　 最后，我们利用分子对接的方法预测了1-17-2Fab与DEC-S的结合位点。通过对抗原抗体复合物模型的分析，我们对抗原表位及抗体的SDR区做出了预测。这些工作为进一步完善抗体人源化及抗体亲和力的体外成熟奠定了理论基础。
　　 总结:我们制备了一株抗人DEC-205分子的单克隆抗体，并且成功地对该抗体进行了人源化改造，人源化改造后的抗体亲和力得到了有效的保存。该抗体能够诱导DC细胞的内吞效应，具备潜在的应用价值。而且，在1-17-2抗体人源化改造的基础上，我们提出了一种新颖的基于表位扫描和分子动力学模拟的抗体人源化改造方法

目录

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 DEC-205分子简介

1．1．1 DEC-205作为抗原识别受体的发现

1．1．2 DEC-205抗原递呈途径的研究

1．2 DEC-205靶向抗体的免疫调节机制

1．2．1 DEC-205靶向抗体在静息状态下诱导免疫耐受

1．2．2 DEC-205靶向抗体在共刺激信号下增强免疫反应

1．2．3 DEC-205靶向抗体递呈抗原途径的选择

1．2．4 DEC-205靶向抗体刺激HIV患者细胞免疫应答

1．3 抗体人源化方法综述

1．3．1 基于理性化设计的抗体人源化方法

1．3．2 基于经验的抗体人源化方法

1．4 分子模拟技术在生物学中的应用

1．4．1 分子模拟技术的理论基础

1．4．2 同源建模的原理与方法

1．4．3 分子动力学模拟的原理与方法

1．4．4 分子对接的原理与方法

第二章 抗DEC-205单克隆抗体的制备及表达检测体系的建立

2．1 前言

2．2 材料方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 DEC-1和DEC-S抗原表达

2．3．2 大鼠免疫以及抗体制备

2．3．3 1-17-2单克隆抗体亚型的鉴定

2．3．4 1-17-2单克隆抗体识别人DC细胞

2．3．5 1-17-2抗体诱导DC内吞现象

2．3．6 1-17-2抗体基因克隆及序列分析

2．3．7 1-17-2抗体的体外重组表达

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 DEC-205单克隆抗体的人源化改造

3．1 前言

3．2 材料方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 抗体可变区序列分析

3．3．2 1-17-2 Fab模型的构建

3．3．3 人源化改造整体策略

3．3．4 基于表位扫描的人源化替换

3．3．5 人源化抗体的构建及亲和力检测

3．3．6 人源化抗体的优化策略

3．3．7 人源化替换突变体模型的构建

3．3．8 关键位点氨基酸的确定

3．3．9 关键位点氨基酸的分析

3．3．10 优化抗体的构建及亲和力检测

3．3．11 优化抗体诱导DC的内吞现象

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 1-17-2 Fab与DEC-S结合位点的分析

4．1 前言

4．2 材料方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 DEC-S模型的构建及退火模拟

4．3．2 DEC-S的结构模型及其评估

4．3．3 DEC-S与1-17-2 Fab的分子对接

4．3．4 抗原抗体复合物结合位点的分析

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

致谢

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