尘螨、豚草、曲霉粗提物诱导的慢性气道炎症及以Syk为靶点化合物Vam3抗炎机制研究

摘要

目前全球大约有3亿人患哮喘，其中多数患者通过吸入免疫抑制剂（如糖皮质激素）和β-肾上腺素受体激动剂治疗急性哮喘，获得良好的效果。然而大约5％～10％的慢性哮喘患者却对此类治疗反应效果较差。基于类固醇拮抗型气道炎症严重影响人类的健康，且发病机制尚未明确，因此在此类疾病的预防、诊断、治疗上还存在很大的缺口，现有的部分临床治疗药物也存在长期的副作用或难吸收等各种各样的问题，研究类固醇拮抗型气道炎症机制和开发针对此类疾病有效的药物成为当前急需解决的问题。本研究的目的是探索慢性气道炎症机制，并评价以Km（米氏常数）原理高通量筛选的Syk激酶特异性抑制剂Vam3的抗炎机制，以期开发出具有治疗慢性气道炎症的一类新药。
　　 大多数哮喘患者的致敏原为环境中的多种抗原，但在多数实验动物模型中只使用一种过敏原，不能反映患者发病机制的本质。本研究通过采用患者常见的尘螨、豚草和曲霉菌属组成的3类过敏原复合物(DRA)免疫动物，建立了慢性哮喘模型，并发现在慢性气道炎症中通过NF-κB影响炎症因子IL-8表达与活性的作用机制。首先，将雌性BALB/c小鼠分为3组，模型组和药物组中尘螨、豚草和曲霉菌属（DRA）作为抗原，生理盐水作为对照，重复免疫动物10周。其次，药物组中地塞米松作为治疗药物，对照组和模型组中生理盐水作为安慰剂，口服灌胃两周，每天1次。结果观察到DRA增加了小鼠支气管肺泡灌流(BAL)液中的IL-10、TGF-β水平和中性粒细胞在肺组织中募集。地塞米松降低了炎症相关细胞因子的水平，抑制了肺组织中肥大细胞的浸润和粘液高分泌。但是，地塞米松并没有降低反而增加了肺组织中性粒细胞浸润和与人类功能同源的IL-8的水平。体外研究发现，尘螨主要抗原组分Der p1可刺激人肺泡上皮A549细胞，增强了IL-8的基因表达和NF-κB的活性。然而，未见地塞米松抑制A549细胞中升高的IL-8水平，但NF-κB抑制剂BAY11-7082却降低了IL-8的高表达。实验结果表明IL-8水平的增加可能参与类固醇拮抗型中性粒细胞型气道炎症，而这种机制可能与通过激活NF-κB途径有关。
　　 脾酪氨酸激酶(Syk)可表达于T细胞、B细胞、肥大细胞等多种免疫细胞内，在急性和慢性炎症中，通过细胞外抗原诱导的IgE受体FcεRI介导的免疫细胞活化中发挥重要作用。本研究的目的是观察二苯乙烯类化合物Vam3对免疫复合物诱导炎症的抑制及其机制。首先，建立了以Km原理高通量化合物筛选模型，观察Vam3对Syk激酶的抑制作用。其次，通过活化IgE受体FcεRI介导的免疫细胞活化，评价Vam3在细胞水平上的抗炎作用。最后，应用蛋白免疫印迹技术评价Vam3对Syk激酶下游信号通路的影响。结果观察到二苯乙烯类化合物Vam3竞争性抑制了Syk激酶的催化活性，其Ki和IC50值分别为61.09nM和62.95nM。Vam3在细胞水平上以剂量依赖的方式降低了大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞内Ca2+的水平。同时，Vam3抑制了多种炎症介质的产生，如肿瘤坏死因子TNF-α，IL-6，IL-8等，其IC50值分别为3.2μM、2.43μM、1.3μM。此外，通过蛋白免疫印迹技术发现Vam3能够抑制Syk蛋白激酶的Y525/526位点、下游分子LAT的Y191位点、cPLA2的S505位点、PLCγ-1的Y783位点和S1248位点的磷酸化。实验结果表明了Vam3是通过抑制Syk的催化活性，导致下游分子LAT、cPLA2、PLCγ-1活化的抑制，进而抑制炎症细胞的活化和下游炎症因子的释放。本研究所建立的高通量筛选Syk激酶特异性抑制方法为以Syk为靶点的抗哮喘药物筛选及其抗哮喘慢性气道炎症机制研究提供了实验依据。

目录

缩略词

摘要

前言

1 哮喘

1．1 支气管哮喘病的研究现状

1．2 诱导哮喘发病的因素和发病机制

1．3 哮喘发病的病理及病理生理学改变

1．4 哮喘的治疗

2 酪氨酸激酶

2．1 受体型酪氨酸激酶信号通路与特异抑制剂

2．2 非受体型酪氨酸激酶信号通路与特异性抑制剂

2．3 非特异性酪氨酸激酶抑制剂

2．4 丝／苏氨酸激酶信号通路与治疗过敏性哮喘

2．5 核转录因子抑制剂与治疗过敏性哮喘

3 Vam3简介

4 本文研究目标

5 技术路线

第一部分 类固醇拮抗性哮喘病理机制的研究

实验材料

1 实验材料

实验方法

2 实验方法

结果

1 多重抗原DRA的重复刺激诱导嗜中性粒细胞型气道炎症，气道重塑，肥大细胞浸染和黏液高分泌

2 地塞米松抑制小鼠肺BAL液中免疫细胞数目的增加，但对嗜中性粒细胞无作用

3 多重抗原DRA的刺激增强BAL液中IL-8和其他细胞因子的水平

4 多重抗原DRA的刺激增强外周血中IgE的水平

5 地塞米松不能抑制Der p1活化的NF-κB信号通路

6 抗原Der p1通过NF-κB信号通路增强IL-8的表达

讨论

小结

第二部分 Vam3通过Syk信号通路抑制了抗原诱导的炎症

实验材料

1 实验材料

实验方法

2 实验方法

结果

1 Vam3抑制肥大细胞脱颗粒

2 Vam3抑制Raw 264．7细胞内TNF-α的水平

3 Vam3抑制THP-1细胞内IL-8的水平

4 Vam3抑制多种炎症细胞内相关炎症因子的水平

5 Vam3特异性抑制Syk激酶的活性

6 Vam3抑制Syk激酶的活化

7 Vam3抑制胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)和LAT激酶的磷酸化

8 Vam3抑制磷脂酶Cγ1(PLCγ-1)激酶的磷酸化

讨论

小结

参考文献

博士在读期间发表与待发表的文章

论文说明

文献综述

致谢

声明