第一部分单核细胞亚群在原发免疫性血小板减少症中的分布及功能研究;第二部分IL-35在原发免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义

摘要

第一部分单核细胞亚群在原发免疫性血小板减少症中的分布及功能研究
　　 研究背景:单核细胞是一群极具异质性的细胞，在固有免疫、炎症和自身免疫反应中发挥着重要的作用。1989年，在二色法流式细胞术基础上，一种新的CD16+单核细胞被首次报道。这一群CD16+单核细胞比常规的单核细胞（经典型）有更强的分泌促炎因子能力和抗原递呈能力，因而被认为是一类“促炎单核细胞”，在细菌或病毒感染、炎症性疾病和多种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、克隆氏病中均出现明显扩增。近年来，越来越多的证据支持将这群CD16+单核细胞依据不同的表型和功能进一步细分为:中间型(CD14++CD16+)和非经典型(CD14+CD16++)单核细胞两个亚群。原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)作为一种自身免疫性疾病，存在多种复杂的免疫缺陷，单核细胞亚群在ITP中的分布情况及在发病机制中的作用尚待深入阐明。
　　 目的:研究在ITP病人中，单核细胞亚群的分布情况，并探讨其在ITP发病中的作用机制。
　　 方法:采集外周血，流式细胞术检测71例未治疗活动期ITP患者、23例正在应用糖皮质激素治疗患者和49例健康对照外周血单核细胞亚群的分布情况，分析单核细胞亚群的分布与血小板数之间的关系，ELISA法检测血浆中主要由单核细胞分泌的细胞因子水平。用流式细胞分选技术分选出经典型、中间型、非经典型三个单核细胞亚群，ELISA法分别检测体外不同亚群在LPS刺激下的分泌细胞因子的能力。将分选出的不同单核细胞亚群分别与CD4+T细胞和自体血小板共培养，Brdu ELISA检测各亚群对血小板特异性自身反应性T细胞增殖的作用，并通过ELISA检测共培养上清IFN-γ水平了解其对于Th1细胞分化的影响。
　　 结果:结果显示，未治疗的活动期ITP患者非经典型单核细胞出现显著扩增(ITP:5.44％[0.36％-22.29％] vs Ctrl:1.83％[0.12％-7.11％]，p＜0.001)，中间型单核细胞的比例也明显增加(ITP:10.54％[5.01％-45.15％] vs Ctrl:7.6％[1.6％-23.99％]，p＜0.001)，经典型单核细胞比例明显减少(ITP:82.6％[51.23％-92.38％] vs Ctrl:90.75％[66.83％-95.92％]，p=0.001)。并且，中间型和非经典型单核细胞与血小板数呈负相关，而经典型单核细胞与血小板数呈正相关。其中9例患者在病情完全缓解后再次检测，非经典单核细胞亚群的比例明显下降（未治疗:7.47％[0.57％-11.85％]vs完全缓解:1.16％[0-8.78％]，p=0.015），而中间型和经典型单核细胞比例无明显变化。在23例正在应用糖皮质激素治疗患者，非经典型单核细胞较未治疗组显著减少(p＜0.001)，经典型单核细胞比例恢复至接近正常对照水平。活动期1TP患者的中间型单核细胞分泌的TNF-α水平较经典型单核细胞(p=0.049)和非经典型单核细胞(p=0.007)明显升高。同样，活动期ITP患者的中间型单核细胞分泌的IL-1β水平较经典型单核细胞（p=0.028）和非经典型单核细胞(p=0.023)明显升高。经过体外共培养，非经典型单核细胞较中间型单核细胞显示出更强的促进自身反应性T细胞增殖的能力，但差异未达到统计学意义(p=0.066)。还检测了单核细胞亚群与自体CD4+T细胞和血小板共培养上清的IFN-γ水平，发现非经典型单核细胞比中间型单核细胞更能促进T细胞分泌IFN-γ(p=0.047)。
　　 结论:由此我们可以得出结论，中间型和非经典型单核细胞在ITP患者中出现明显扩增，糖皮质激素治疗可以迅速逆转非经典型单核细胞的扩增。中间型单核细胞具有更强的细胞因子分泌能力，非经典型单核细胞能够促进自身反应性T细胞增殖以及Th1细胞的分化，从而对ITP的发病起到重要的作用。
　　 第二部分IL-35在原发免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义
　　 研究背景:原发免疫性血小板减少症(primary immune thorombocytopenia, ITP)是一种以血小板减少，皮肤黏膜出血为主要表现的自身免疫性疾病，发病机制复杂。IL-35是近年新发现的一种具有抗炎作用的细胞因子，是IL-12家族的新成员，由P35和EBI3两个亚基组成。研究显示，IL-35主要由活化的调节性T细胞分泌，可以抑制CD4+效应T细胞从而减轻炎症和自身免疫反应，并且，IL-35可以通过“传染性耐受”将传统T细胞转化为能够进一步分泌IL-35的诱导型调节性T细胞。但是，关于IL-35的研究多在健康人及实验动物中进行，其在ITP中的作用研究尚待进一步阐明。
　　 方法:用ELISA方法检测36例活动期ITP患者和20例缓解期ITP患者血浆中IL-35，TGF-β1和IL-10的水平，以30例健康人作为对照。进一步分析IL-35水平与ITP患者各临床参数之间的关系。用实时定量PCR的方法检测患者和健康对照外周血单个核细胞中IL-35两个亚基P35和EBI3 mRNA的表达水平。
　　 结果:通过ELISA检测，我们发现活动期ITP患者血浆中IL-35的水平较缓解期ITP患者(p=0.017)及健康对照(p＜0.001)显著降低，并且，缓解期患者血浆中IL-35的水平仍低于健康对照(p＜0.001)。在活动期患者，血浆IL-35的水平与血小板数呈显著正相关关系(r=0.5335，p＜0.001)，但在治疗组和未治疗组之间无明显差异。实时定量PCR结果显示，活动期ITP患者P35 mRNA表达水平低于缓解期患者和健康对照，缓解期患者与健康对照相近。而EBI3的mRNA表达变化在活动期，缓解期患者和健康对照之间没有显著差异。
　　 结论:以上结果显示，IL-35在活动期ITP患者外周血血浆内明显降低，并且与血小板数密切相关，提示IL-35直接反映了疾病的活动状态，可能促进了调节性T细胞的失能，在ITP的发病中具有重要作用。活动期ITP患者IL-35 P35亚基mRNA的表达减低，提示在ITP患者中可能由于P35亚基在转录水平的低表达导致外周血血浆中IL-35水平下降。

目录

第一部分 单核细胞亚群在原发免疫性血小板减少症中的分布及功能研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 IL-35在原发免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录一 主要仪器材料及试剂

附录二 主要溶液的配制

附录三 英文缩写和代码

附录四 在读期间发表文章、参加会议

致谢

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