生物钟基因CLOCK促进神经胶质瘤的细胞增殖和迁移

摘要

在生物体中，周期节律作为神经、体液和免疫调节系统以外的另一个调节系统在机体正常功能的维持中起着非常重要的功能。周期节律的破坏会导致机体患病的几率增加，包括癌症的发生。正常的周期节律受到一组核心钟基因通过转录-翻译负反馈环路精细调控。已有研究指出，在哺乳动物中，约10％的基因受到钟基因的调控，正因为钟基因对多基因的调控，它可以参与到不同的细胞信号通路当中，在肿瘤中可以作为癌基因或抑癌基因发挥功能。MiRNAs是能在转录后调控基因表达的小非编码RNA，它可以通过结合到靶基因的3'UTR抑制基因的翻译或导致mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。MiRNA的改变在包括神经胶质瘤在内的肿瘤的发生发展中发挥着重要功能。Xia et al.发现miR-124在胶质瘤中表达降低并证明了miR-124在细胞中通过作用于特定的靶基因如SNAI2抑制胶质瘤的增殖、迁移和成瘤。虽然钟基因和miRNAs在肿瘤中的功能都已有相当多的研究，但是关于钟基因和miRNAs的相互作用对神经胶质瘤的影响还知之甚少。
　　为了研究核心钟基因CLOCK在神经胶质瘤中的分子机理，我们首先检测了16例不同级别的胶质瘤组织和两例正常脑组织中CLOCK蛋白的表达差异，发现Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织中的CLOCK表达高于Ⅱ级胶质瘤组织及正常脑组织。同时，也发现CLOCK在四种胶质瘤细胞系U87MG，T98G，A172，和U251中的表达高于正常胶质细胞系HASP和HEB。然后我们以siRNA在T98G, U87MG中敲低CLOCK，通过MTT实验，克隆形成实验，划痕实验和Transwell等实验发现敲低CLOCK后抑制了肿瘤细胞的增值，存活，以及迁移。
　　之后，我们用TargetScan和PicTar软件系统预测到CLOCK3'UTR含有miR-124和miR181b的靶点。通过荧光素酶报告基因实验和突变实验我们验证了miR-124可直接作用于CLOCK3'UTR并影响CLOCK的表达。
　　为了进一步探索CLOCK和miR-124在神经胶质瘤中相互作用的分子机理，通过在T98G和U87MG中转入CLOCK siRNA或者miR-124 mimics，我们发现无论是敲低CLOCK还是过表达miR-124都会使NF-κB的活性降低。NF-κB通路在肿瘤中发挥着重要功能，通过软件预测未发现miR-124可靶向作用于NF-κB亚基，因此miR-124对NF-κB的活性的影响可能是通过下调CLOCK发挥功能的。
　　总而言之，我们发现CLOCK在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织中的表达较Ⅱ级胶质瘤组织及正常脑组织增高，以及胶质瘤细胞系中CLOCK较正常星形胶质细胞系增高。Silber, Lim，Xia等发现miR-124在神经胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中表达较正常脑组织和正常胶质细胞系低，在本实验室的前期工作中，Tan et al.也验证了miR-124的表达在胶质瘤细胞系中比正常胶质细胞系降低。我们随后证实了miR-124能直接作用于CLOCK3'UTR，并且在胶质瘤细胞T98G中过表达miR-124或者敲低CLOCK均会使NF-κB的活性降低。我们的研究表明CLOCK作为具有胶质瘤抑制功能的miR-124的靶基因，可通过影响NF-κB的活性促进神经胶质瘤的增殖和迁移。

目录

摘要

前言

实验材料

1．主要化学试剂及实验材料

2．主要仪器

3．工具酶、相对分子质量标准及试剂盒

4．抗体

5．质粒构建载体

6．DNA引物和合成的小RNA

7．菌株

8．细胞株

9．细胞培养基

10．人正常脑组织和神经胶质瘤样本

11．软件及网络资源

实验方法

1．组织及细胞总蛋白的提取

2．蛋白质浓度测定

2．1 实验原理

2．2 试剂

2．3 实验步骤

3．Western blotting蛋白印记实验

3．1 WeStern-blotting杂交用液

3．2 Western-Blotting蛋白印迹杂交

4．细胞总RNA的提取

5．实时荧光定量PCR

5．1 原理

5．2 模板的制备

5．3 实时定量PCR

6．克隆构建

6．1 PCR反应

6．2 PCR反应程序

6．3 限制性内切酶酶切反应

6．4 酶切产物回收

6．5 连接

6．6 转化

6．7 接菌

6．8 质粒抽提

6．9 酶切鉴定

6．10 测序及结果分析

7．细胞培养及转染

7．1 细胞培养及传代

7．2 转染

8．MTT

8．1 原理

8．2 MTT溶液的配制

8．3 操作步骤

9．克隆形成实验

10．TRANSWELL细胞迁移实验

10．1 实验原理

10．2 实验步骤

11．细胞划痕实验

11．1 实验原理

11．2 实验步骤

12．荧光素酶报告基因实验

12．1 原理

12．2 细胞样品的准备

12．3 荧光素酶基因活性检测

13．数据处理和分析

结果

1．胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中CLOCK蛋白表达检测

2．CLOCK对神经胶质瘤细胞的生长的影响

3．CLOCK对神经胶质瘤细胞的迁移的影响

4．miR-124在胶质瘤细胞中对CLOCK的靶向作用检测

5．MiR-124和CLOCK胶质瘤细胞中NF-κB的活性的影响

讨论

1．CLOCK蛋白在胶质瘤中高表达提示CLOCK可能在胶质瘤发生发展中发挥功能

2．生物钟基因CLOCK在胶质瘤中发挥促进肿瘤细胞生长和迁移作用

3．胶质瘤中miR-124的低表达可能是CLOCK高表达的原因

4．CLOCK对NF-κB活性的影响

5．miR-124-CLOCK-NF-κB在神经胶质瘤中的关系

小结

不足与展望

参考文献

论文综述 昼夜节律生物钟及其与肿瘤的关系

附录

个人简历

论文和会议摘要

致谢

声明