基于蛋白芯片技术研究ox-LDL损伤血管内皮的分子靶标及中药创新药物的发现和机制探讨

摘要

目的：
　　 1.利用蛋白芯片技术从氧化应激及炎症两个关键环节系统分析氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮损伤的凋亡相关蛋白及炎症因子水平的变化，探讨氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮损伤致动脉粥样硬化可能的信号通路及分子靶标，并在动脉粥样硬化模型载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠体内进行验证。为进一步研究药物抗动脉粥样硬化分子机理奠定理论基础;
　　 2.对于临床确有疗效、且作用明确的中药复方冠心丹参方，在细胞水平对其开展物质基础研究，对其主要活性成分开展靶点的确证和新治疗靶点的发现研究。同时利用中效原理，在内皮损伤模型上对“冠心丹参方”中主要活性成分进行协同配伍研究，探讨复方有效成分群协同增效发挥网络综合效应作用机制;进而为名优中成药的二次开发奠定基础，促进中药复方的现代化;
　　 3.对中药黄酮类单体化合物成分进行活性筛选及比较，对活性较强的有效成分杨梅苷进行抗动脉粥样硬化的分子机制研究。为发现及开发中药新药提供科学依据，促进我国特色的原创治疗药的研究与开发。
　　 方法：
　　 1.运用多重检测手段（细胞活力，流式细胞术，DNA末端转移酶标记技术，线粒体膜电位荧光染色）建立稳定了氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮(HUVECs)损伤模型，并采用凋亡蛋白芯片（43种）及炎症因子蛋白芯片（40种）对血管内皮损伤模型进行靶点分析，并在动脉粥样硬化模型载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠体内进行氧化型脂质，内皮损伤程度进行验证。
　　 2.活血化瘀名方“冠心丹参方”中的19种有效成分及10种黄酮类天然化合物在血管内皮细胞损伤模型上进行了活性筛选。在网络药理学技术指导下，以抗氧化抗炎共同起效抗细胞凋亡为理论依据，运用中效原理，在血管内皮细胞损伤模型上对“冠心丹参方”中主要活性成分丹酚酸B和三七皂苷R1进行两药配伍，对复方有效成分群协同增效发挥网络综合效应进行初探。
　　 3.结合病理学技术（油红O，免疫组织化学），生化指标（血脂，炎症因子，脂质过氧化产物，抗氧化酶），细胞分子生物学技术(western blot，RT-PCR，EMSA)以及小动物活体影像学技术（超声，micro-CT，LPO炎性探针活体荧光成像），对两个活性分子人参皂苷F1（“冠心丹参方”内稀有皂苷）和杨梅苷（黄酮类）从细胞水平和整体动物水平对保护人脐静脉内皮损伤抗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成进行了深入全面的研究。
　　 结果：
　　 1.Ox-LDL诱导HUVECs损伤致动脉粥样硬化的分子机制研究
　　 1.1 Ox-LDL对HUVECs的损伤呈现浓度时间依赖性，最终ox-LDL(70μg/ml)损伤24h被确定为最佳模型条件，细胞活力下降50％，凋亡率达到30％以上，线粒体膜电位下降，ox-LDL受体LOX-1及免疫炎性反应受体TLR-2，TLR-4的蛋白表达量明显升高。
　　 1.2凋亡蛋白芯片的靶点筛选结果显示，氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮的作用主要影响在Bcl-2家族蛋白(Bax、Bad、Bim)，IAP家族抗细胞凋亡蛋白(XIAP、cIAP1/2、survivin)，HSP热休克蛋白家族(HSP27/60/70)以及胰岛素样受体蛋白家族(IGFBP-1/2)。进一步通过蛋白免疫印迹技术验证结果与芯片结果相一致，并提示Ox-LDL诱导HUVECs损伤可能与激活线粒体凋亡通路，影响抗氧化通路如Nrf2/HO-1及细胞生存通路如PI3K/Akt等相关。
　　 1.3炎症因子蛋白芯片的靶点筛选结果显示，氧化型低密度脂蛋白能上调人脐静脉内皮上清液中的单核细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，巨噬细胞炎症因子1δ(MIP-1δ)，内皮粘附分子ICAM-1，干扰素IFNγ，γ干扰素诱导单核细胞因子(MIG)，瘤坏死因子TNF-α及其受体R1，白细胞介素IL-1，IL-4，IL-6，IL-11，IL-12p70，IL-12p90，IL-15，IL-16等炎症因子。进一步通过酶联免疫吸附法验证结果与芯片结果相一致，并提示Ox-LDL诱导HUVECs损伤可能与TLR/NF-kB，MAPK等炎症免疫信号通路相关。
　　 2.“冠心丹参方”保护内皮损伤的活性成分确认及新药发现和分子机制研究
　　 2.1“冠心丹参方”中筛选出对ox-LDL诱导的HUVECs损伤具有保护活性的有效成分有:丹酚酸A，B，迷迭香酸，丹参酮ⅡA磺酸钠，三七皂苷R1，R2，人参皂苷Rb1，F1，七叶胆苷X(Ⅶ)，人参皂苷RK3，木犀草素，木犀草苷。
　　 2.2“冠心丹参方”中含量较高且活性较好的代表性成分丹酚酸B与三七皂苷R1中效配伍的结果:两药联合应用效果明显优于单一用药（以等剂量R1效应为1），且丹酚酸B:三七皂苷R1比例为1∶3时效果最佳。
　　 2.3“冠心丹参方”中新发现的内皮保护活性成分人参皂苷F1对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的分子机制及抗动脉粥样硬化作用的研究结果:人参皂苷F1(50mg/kg)灌胃给药6周能减小高脂饲料诱导的ApoE-/-小鼠主动脉弓动脉粥样硬化斑块面积，通过LPO炎性探针活体成像显示，F1对高脂血症下的炎性反应具有明显的抑制作用。体外研究表明，人参皂苷F1(1，4，16μM)可以呈剂量依赖性抑制ox-LDL引起HUVECs，高剂量效果与阳性对照普罗布考(20μM)效果接近。凋亡人参皂苷F1能有效抑制人单核细胞THP-1对人脐静脉内皮细胞HUVECs的粘附，抑制ox-LDL引起的HUVECs膜受体LOX-1，TLR-4的表达，阻断NF-kB的核转位，下调TNF-α，IL-6，G-CSF，MIP-1δ，ICAM-1，MIG，IL-1，IL-15，IL-16表达水平。
　　 3.黄酮类化合物保护内皮损伤的活性成分筛选及新药发现和分子机制研究
　　 3.1黄酮类化合物中筛选出对ox-LDL诱导的HUVECs损伤具有保护活性的有效成分有:杨梅素，杨梅苷，二氢杨梅素，异鼠李素。
　　 3.2新发现的内皮保护活性成分杨梅苷对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的分子机制及抗动脉粥样硬化作用的研究结果:杨梅苷(50mg/kg)灌胃给药6周能有效抑制高脂饲料诱导的ApoE-/-小鼠主动脉弓动脉粥样硬化斑块的形成，结果通过小动物主动脉弓超声成像，micro-CT钙化斑点成像以及组织切片油红O染色，内皮细胞凋亡TUNEL染色，Casepase-3染色进行了全面评价，。虽不影响小鼠体重和血清血脂(TC，HDL-C，LDL-C，TC)，但可以降低血清ox-LDL水平，炎症因子MCP-1，sICAM-1，CRP水平，脂质过氧化产物MDA和4-HNE，抗氧化物酶(CAT，SOD，GSH-px)。体外研究表明，杨梅苷(10，20，40μM)可以呈剂量依赖性抑制ox-LDL引起HUVECs凋亡，高剂量效果与阳性对照普罗布考(40μM)效果接近。其主要机制为抑制LOX-1受体表达及其介导的ROS释放，活化PI3K/Akt/eNOS和Stat3/HO-1两条信号通路，下调促细胞凋亡蛋白Bax，Bad和抗细胞凋亡蛋白XIAP，cIAP-2，survivin从而阻断细胞凋亡。
　　 结论：
　　 1.蛋白芯片结果显示ox-LDL对血管内皮细胞损伤致动脉粥样硬化的作用是氧化应激反应，炎症反应导致内皮细胞凋亡，功能紊乱的综合结果，可能与抗氧化，细胞线粒体凋亡，细胞生存增殖，免疫炎症通路相关。
　　 2.通过对冠心丹参方有效成分和黄酮单体的活性筛选结果提示，具有抗氧化活性（如黄酮，酚酸类）和/或抗炎活性的药物（如皂苷类）对ox-LDL诱导的血管内皮损伤存在保护活性，对于研究成为保护内皮，抗动脉粥样硬化及防治其他心血管疾病的候选新药有潜在的开发价值，大量的天然活性药物成分及传统复方在治疗致病机理复杂的疾病中有较好的新药研发前景。
　　 3.对“冠心丹参方”中两个主要活性成分丹酚酸B和人参皂苷R1在ox-LDL诱导的血管内皮损伤模型上进行配伍的结果表明，两药合用效果优于单一用药，且丹酚酸B:三七皂苷R1比例为1∶3时效果最佳。
　　 4.对皂苷类化合物人参皂苷F1（“冠心丹参方”中成分）保护血管内皮损伤和抗动脉粥样硬活性的研究结果表明，通过减轻血管内皮的炎症反应从而抑制早期动脉粥样硬化的发生。其主要机制为抑制人单核细胞对血管内皮的粘附，抑制ox-LDL引起的HUVECs膜受体LOX-1，TLR-4的表达，阻断NF-kB的核转位，减少多种炎症因子的释放。
　　 5.对黄酮类化合物杨梅苷保护血管内皮损伤和抗动脉粥样硬活性的研究结果表明，杨梅苷通过减少血管内皮细胞从而抑制早期动脉粥样硬化斑块的生成。其主要机制为抑制LOX-1受体表达及其介导的ROS释放，活化PI3K/Akt/eNOS和Stat3/HO-1两条信号通路，下调促细胞凋亡蛋白Bax，Bad和抗细胞凋亡蛋白XIAP，cIAP-2，survivin从而阻断细胞凋亡。

目录

声明

英文缩略词

摘要

引言

第一章 氧化型低密度脂蛋白损伤内皮致动脉粥样硬化的机制研究

前言

第一节 Ox-LDL诱导HUVECs损伤模型的建立

材料与方法

结果

结论

第二节 Ox-LDL诱导HUVECs损伤的凋亡靶点及炎性因子分析

材料与方法

结果

结论

第三节 高脂诱导ApoE-／-小鼠血管内皮损伤及动脉粥样硬化模型的建立

材料与方法

结果

结论

讨论

参考文献

第二章 “冠心丹参方”保护内皮损伤的活性成分确认及新药发现和分子机制研究

第一节 基于抗动脉粥样硬化疗效的中药复方“冠心丹参方”保护内皮损伤的活性成分确认

前言

材料与方法

结果

结论

第二节 “冠心丹参方”两种活性成分配伍协同增效保护ox-LDL诱导HUVECs损伤的研究

前言

材料及方法

结果

结论

第三节 人参皂苷F1抗炎保护ox-LDL诱导的HUVECs损伤的分子机制及抑制动脉粥样硬化炎性反应的研究

前言

材料和方法

结果

结论

讨论

参考文献

第三章 黄酮类化合物保护内皮损伤活性的筛选及新药发现和分子机制的研究

第一节 基于黄酮类化合物抗氧化抗炎功能的活性成分筛选

前言

材料及方法

结果

结论

第二节 杨梅苷抗凋亡保护ox-LDL诱导HUVECs损伤的分子机制及抑制早期动脉粥样硬化斑块生成的研究

前言

材料和方法

结果

结论

讨论

参考文献

结语

综述

致谢

作者简介及发表文章