SPATA7突变导至Leber先天性黑矇的分子机制研究

摘要

Leber先天性黑矇（Leber congenital amaurosis，LCA）是一种导致婴幼儿先天性双眼盲的严重遗传性视网膜病变，发病最早、病情最严重，占学龄儿童盲的20％。LCA基因治疗的成功，为其他遗传性视网膜疾病的治疗带来了希望。近年来LCA的基因研究成为眼科学和遗传学的热点。SPATA7基因是2009年报道的一个LCA致病基因，突变可导致LCA或早发型视网膜色素变性两种不同的视网膜病变，具有潜在的重要研究价值。但目前SPATA7编码蛋白的功能尚不明确，SPATA7在视网膜中发挥的作用尚不清楚，突变导致LCA的分子机制国内外尚无任何报道。
　　 目的：
　　 探索SPATA7蛋白在视网膜发育及成熟视网膜中发挥的作用，研究SPATA7突变对视网膜的影响以及可能参与的信号通路，初步了解SPATA7突变导致LCA可能的分子机制。
　　 方法：
　　 本实验包括两个部分，第一部分通过不同周龄小鼠视网膜切片SPATA7蛋白免疫组织化学染色方法研究SPATA7在视网膜中的时空表达情况，然后采用western blot和细胞免疫组化方法验证SPATA7在视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)细胞中的表达。第二部分应用RNA干扰技术沉默SPATA7基因，制各稳定低表达SPATA7的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19），通过CCK-8法和细胞划痕实验分别检测SPATA7正常表达及抑制表达的ARPE-19细胞在增殖、移行修复等细胞行为学方面的差异，并通过检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27、p15表达水平的变化探索SPATA7在RPE细胞周期中可能参与的信号通路。
　　 结果：
　　 1.小鼠视网膜切片免疫组织化学染色及ARPE-19细胞SPATA7蛋白的westernblot验证，发现SPATA7主要在视网膜RPE层高表达。ARPE-19细胞免疫组织化学染色发现SPATA7蛋白位于RPE细胞胞浆中。
　　 2.根据不同周龄小鼠视网膜切片免疫组织化学染色结果，SPATA7在视网膜发育的晚期阶段开始表达，并逐渐增强，在成熟期视网膜RPE层高表达。
　　 3.通过RNA干扰技术沉默SPATA7基因，成功构建了稳定低表达SPATA7的ARPE-19细胞株。
　　 4.SPATA7基因沉默后ARPE-19细胞的增殖和移行修复能力受到明显抑制。
　　 5.SPATA7基因沉默后ARPE-19细胞中p27和p15表达水平明显上调。
　　 结论：
　　 1.小鼠视网膜切片免疫组化染色结果表明，SPATA7在发育晚期阶段视网膜RPE层中开始表达，并逐渐增强，并在成熟期视网膜RPE层高表达，提示SPATA7可能主要在视网膜发育的较晚期阶段及成熟视网膜中发挥作用。ARPE-19细胞免疫组织化学染色表明SPATA7蛋白主要位于RPE细胞胞浆中。
　　 2.SPATA7基因沉默后，ARPE-19细胞增殖生长和移行修复能力受到明显抑制，提示SPATA7可能参与调节视网膜晚期发育阶段RPE细胞的增殖以及成熟期视网膜RPE细胞的细胞周期和移行修复等细胞行为。
　　 3.SPATA7可能通过参与调节RPE细胞中p27、p15等CKI细胞因子的表达，从而参与调控视网膜发育晚期阶段RPE细胞的增殖及成熟期视网膜RPE细胞的细胞周期。

目录

缩略词表

摘要

引言

参考文献

材料和设备

一、主要材料、试剂

二、主要仪器、设备和软件

第一部分 SPATA7在视网膜中表达的定位研究

前言

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 SPATA7基因沉默对ARPE-19细胞行为学影响及相关信号通路检测

前言

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

致谢

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