单细胞测序技术在病原体检测中的初步研究

摘要

近年来，严重急性呼吸综合征(SARS)、人感染H7N9禽流感等新型传染病相继暴发，严重威胁着人民健康、社会经济可持续发展和国家安全，对传染病的控制带来了严峻的挑战。病原体检测是传染病控制中重要的环节，越来越多的新技术已经应用其中，诸如第二代高通量测序技术已在实际工作中取得了卓越的成果，但是在单个感染细胞和单个病原体的检测研究中仍存在着不足和迫切需求。目前蓬勃发展的单细胞测序技术为此带来了曙光，单细胞测序技术被《Science》杂志评为2013年六大值得关注的科学领域之一，目前主要集中于单个肿瘤细胞或单倍体细胞之间的比较基因组研究，而在病原体检测领域鲜有研究报道。 本研究根据传染病的病原体检测需求，结合单细胞测序技术和第二代高通量测序技术，以病毒感染细胞后单个细胞中病毒的高通量检测为入手点，初步探索病原体检测领域中单细胞测序技术的应用。 本研究以本实验室分离的肠道病毒coxsackievirus A16侵染人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD)细胞作为初始材料，运用激光捕获显微切割技术分离得到单细胞，采用随机反转录PCR扩增胞内病毒基因组，应用Ion Torrent离子半导体测序技术进行高通量测序分析。结果得到42.25％的基因组覆盖率，所得序列在5'UTR、VP4、VP1、2A、2C和3C区域基因组覆盖率大于60％，同时还发现了8处核苷酸突变，可以鉴定所感染的病原体及其型别，初步尝试探索了单细胞测序技术在病原体检测中的应用。 此外，本研究还对7-羟基黄酮(7-hydroxyflavone，HF)和二异丙基酰黄酮7酰磷酸(diisopropyl-flavon7-yl phosphate，FIP)抑制肠道病毒71型的复制进行了研究，通过分子模拟、体外蛋白酶活性抑制试验以及抗病毒试验等发现HF和FIP对EV71的复制具有较强的抑制效果，这些发现将有助于抗肠道病毒71型药物的研究。

目录

摘要

第一部分

第一章 引言

1．1 单细胞分离技术

1．2 单细胞全基因组扩增方法

1．3 单细胞基因组高通量测序

1．4 本章小结

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 实验结果

3．1 病毒滴度测定

3．2 制备细胞涂片

3．3 单细胞切割

3．4 病毒核酸提取及随机反转录PCR

3．5 Ion torrent文库建立

3．6 Ion torrent高通量测序结果

3．7 数据分析

第四章 讨论

第二部分 7-羟基黄酮和二异丙基酰黄酮7酰磷酸抑制肠道病毒71型的复制

第一章 引言

第二章 实验材料与方法

第三章 实验结果

3．1 HF和EV71 3Cpro的对接模拟

3．2 FIP在体外对EV71 3Cpro蛋白酶活性的抑制作用

3．3 HF和FIP在RD细胞中的毒性

3．4 HF和FIP保护RD细胞免遭EV71感染

3．5 HF和FIP抑制EV71在细胞中的复制

3．6 HF和FIP抑制CAV和CBV的复制

第四章 讨论

参考文献

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