ERAP1基因多态性与丙型肝炎病毒感染及非小细胞肺癌的相关性研究

摘要

背景:MHCⅠ类抗原呈递基因系统在对抗病毒的有效应答中起着关键作用。内质网氨肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase1，ERAP1)是抗原递呈中的重要分子，已有研究报道，ERAP1基因的多态性可影响抗原呈递，引起免疫应答的差异导致与疾病的关联不同。目前的研究集中于自身免疫性疾病，已有多个研究发现ERAP1与自身免疫性疾病的发生发展密切相关。那么，ERAP1基因单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)是否会影响抗原呈递过程从而与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、非小细胞性肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患病风险相关有待于进一步探讨。此外，云南省由于其独特的地理位置，成为HCV等血液传播疾病传入我国大陆的重要门户，也使其HCV的分布呈现出与其他地区不同的特点。因此，本研究首先开展了ERAP1与HCV感染及NSCLC的相关性研究，在此基础上，结合云南人群HCV感染特点，对不同的HCV基因型与ERAP1基因多态性之间的相关性进行了初步探讨。 方法:本研究分为三部分。第一部分以云南地区HCV感染者376名、正常健康对照324名为研究对象，研究ERAP1基因单核苷酸多态性与HCV感染的相关性。采用Taq Man探针基因分型方法检测云南汉族正常人群及HCV感染者的ERAP1基因单核苷酸多态性，进行HCV感染的关联性分析。第二部分以云南地区HCV一般感染人群(general population，GP)为研究对象，首先研究一般感染人群中HCV基因型和亚型的流行状况。采用RT-PCR的方法扩增HCV NS5B片段并测序，对云南一般人群HCV感染者进行HCV基因分型，探索云南一般感染人群HCV流行趋势。在此基础上，结合HCV感染者的ERAP1基因信息，分析不同HCV基因型与ERAP1基因多态性的相关性。第三部分以云南地区非小细胞肺癌患者224例、正常健康对照组207例为研究对象，研究ERAP1基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌的遗传易感性。采用Taq Man探针基因分型方法对ERAP1基因单核苷酸多态性进行分析，探索ERAP1基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌患病风险的相关性。 结果:(1) HCV感染组和对照组4个ERAP1基因SNP位点基因型的分布符合HWE平衡，人群具有代表性。其中rs26618基因型和等位基因型频率在病例组和对照组中的差异具有统计学意义(P＜0.05)，病例组和对照组rs27044/rs30187/rs26618/rs26653-CCCG的单倍型频率差异具有统计学意义，P值为0.029(P＜0.05)。(2)云南地区一般感染人群存在4种HCV基因型（1、2、3和6），7种HCV亚型(1b、2a、3a、3b、6a、6n和6k)。HCV3型是主要流行的基因型，频率为0.484，其次是HCV1型(0.283)、6型(0.133)和2型(0.100);其中HCV3b亚型(0.292)和1b亚型(0.283)是主要流行的亚型。云南一般感染人群HCV的分布呈现出与其他地区不同的特点:HCV1和3型的频率在云南和重庆、云南和广东具有显著性的差异（P＜0.05），而在云南和广西的频率分布相似;HCV6型的频率在云南和广西、广东、越南、缅甸地区分布存在显著性差异（P＜0.05），而云南和重庆的频率分布却相似。另一方面，云南一般感染人群与静脉吸毒人群HCV基因型分布相比较亦存在显著性差异:HCV基因型（1、2和6）及其亚型(1b、2a、6a和6n)在一般感染人群与静脉吸毒人群中的频率有显著性差异(P＜0.05），经HCV3a和6a构树分析，一般感染人群与静脉吸毒人群的HCV基因型分布呈“交叉”样。ERAP1 rs30187位点的基因型频率在不同的HCV基因型（1，2，3和6）和不同的HCV亚型(1b，2a，3a，3b和6n)中有显著性的差异（P＜0.05）。(3) NSCLC病例组和对照组2个ERAP1基因SNP位点基因型的分布符合HWE平衡，人群具有代表性。ERAP1基因rs26618和rs26653基因型和等位基因频率差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组和对照rs26618/rs26653-CG、TC的单倍型频率差异有统计学意义(P＜0.05)。而ERAP1基因rs26618、rs26653位点的基因型和等位基因的频率在腺癌和鳞癌、Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期非小细胞肺癌患者中的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 结论:(1) ERAP1基因多态性与HCV感染有着显著的易感关联，rs27044/rs30187/rs26618/rs26653-CCCG单倍型可能增加HCV感染的患病风险(OR=1.311，95％ CI:1.028～1.671)。(2)云南地区一般感染人群HCV基因型和亚型的分布与静脉吸毒人群有着明显的不同，且HCV基因型和亚型正从静脉吸毒人群向一般感染人群传播。不同的HCV基因型、亚型与ERAP1基因多态性有一定的关联。(3) ERAP1基因多态性与NSCLC的发生有关，rs26618/rs26653-CG单倍型可能增加NSCLC的患病风险(OR=1.725，95％CI:1.270～2.343)，rs26618/rs26653-TC单倍型对NSCLC可能具有保护性作用(OR=0.668，95％CI:0.510～0.874)。

目录

摘要

前言

第一部分：ERAP1基因多态性与HCV感染的相关性研究

(一)实验材料

1．实验对象

2．主要试剂

3．主要仪器

(二)实验方法

1．DNA的提取及定量

2．样本临床指标的检测

3．ERAP1基因单核苷酸多态性(SNP)位点基因分型

4．统计学处理

(三)实验结果与分析

1．研究对象的基本特征

2．TaqMan探针基因分型结果

3．病例组和对照组ERAP1基因的Hardy-Weinberg平衡检验

4．ERAP1多态性位点在病例组与对照组中的等位基因频率和基因型频率

5．ERAP1基因在HCV感染组和对照组中4个多态性位点的连锁不平衡分析

6．HCV感染组与对照组中ERAP1基因多态性位点单倍型频率统计分析

第二部分：云南一般感染人群HCV流行病学分析

(一)实验材料

1．实验对象

2．主要试剂

3．主要仪器

(二)实验方法

1．RNA的提取

2．逆转录(RT)

3．HCV基因NS5B区域扩增

4．数据处理

(三)实验结果与分析

1．扩增产物电泳检测结果

2．PCR扩增产物测序结果

3．云南省一般感染人群HCV基因分型和系统进化树分析

4．云南省和其他地区一般感染人群HCV基因型分布的比较

5．云南省一般感染人群与静脉吸毒人群HCV基因型分布的比较

6．不同地区一般感染人群与静脉吸毒人群HCV基因型分布的比较

7．不同HCV基因型感染者中ERAP1基因型和等位基因的频率分布

第三部分：ERAP1基因多态性与非小细胞肺癌发生发展的相关性研究

(一)实验材料

1．实验对象

2．主要试剂

3．主要仪器

(二)实验方法

1．DNA的提取及定量

2．ERAP1基因SNP位点基因分型

3．统计学处理

(三)实验结果与分析

1．研究对象的一般资料

2．TaqMan探针基因分型结果

3．病例组和对照组ERAP1基因的Hardy-Weinberg平衡检验

4．ERAP1多态性位点在病例组与对照组中的等位基因频率和基因型频率

5．ERAP1基因在NSCLC病例组和对照组中2个多态性位点的连锁不平衡分析

6．ERAP1基因多态性位点NSCLC病例组与对照组中单倍型频率统计分析

7．ERAP1基因多态性位点与非小细胞肺癌各临床参数的关系

三、讨论

四、小结

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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