毕赤酵母不同启动子的作用特点及在HPV16 L1表达中的应用

摘要

研究目的: 探讨不同毕赤酵母启动子在不同培养条件下控制异源蛋白表达的特点;探讨不同启动子及其组合应用对人乳头瘤病毒16型L1蛋白(HPV16 L1)表达的影响;此外，探讨通用质粒载体系统在毕赤酵母和汉逊酵母间的穿梭表达应用。本研究致力于从启动子合理应用角度，优化异源蛋白在酵母中的表达与制备。 研究方法: 以毕赤酵母GS115基因组为模板，经PCR扩增获得PTEF1和PFLD DNA片段，经基因重组分别替换商业化的毕赤酵母载体pPink-LC和pPink-HC中的PAOX1，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因;在不同碳源（葡萄糖、甘油、甲醇、山梨醇）背景下探讨PTEF1指导异源蛋白表达的水平以及与不同碳源利用及菌体生长状态的相关性，此外，考察PTEF1指导HPV16 L1表达的情况;通过不同碳、氮源的组合，探讨PFLD指导GFP及HPV16 L1表达的特点;通过构建PAOX1和PTEF1双启动子表达载体，或多次转化整合两个表达单元于同一染色体中，探讨启动子联合应用对提高HPV16 L1表达水平的影响;通过构建基于汉逊酵母rDNA序列以及汉逊酵母、毕赤酵母来源的不同启动子的通用表达载体，分别转化毕赤酵母和汉逊酵母，探讨其介导在两个宿主系统中的基因整合及蛋白表达。 研究结果: 组成型的PTEF1在以葡萄糖(Glu)或甲醇(M)作为碳源的培养条件下，24h可获得GFP及HPV16 L1的高效表达，之后蛋白表达量急剧下降，而在甘油(Gly)或山梨醇(Sor)培养基中获得了持续高水平表达。以葡萄糖及甘油为碳源的菌获得了更快的生长速率;PFLD在Sor+NH4+、Sor+ MA、M+NH4+和M+MA四种组合诱导培养基中，在24h、48h、72h都获得高效表达，在M+ NH4+和M+MA中表达量最高，而在Glu+NH4+、Glu+MA、Gly+ NH4+和Gly+ MA中则仅获得较少或无明显蛋白表达;PAOX1和PTEF1启动子控制的表达单元可共表达GFP和/或HPV16 L1，但蛋白水平较之单个表达单元有所下降;汉逊酵母的rDNA及自主复制序列(ARS)可介导质粒在毕赤酵母和汉逊酵母中的转化，但转化及整合效率在毕赤酵母中较低，通过无抗性压力多次传代结合抗性筛选，含有汉逊rDNA的质粒能够稳定整合于毕赤酵母染色体基因组中;启动子PMOX以及PAOX1和PTEF1可在两个宿主系统中工作;通用载体介导了GFP及HPV16 L1在两个酵母系统中的有效表达。 研究结论: 本研究应用不同启动子在毕赤酵母中成功实现了异源蛋白的表达;显示了不同培养条件对启动子作用及蛋白表达具有显著影响;证实不同启动子控制的多表达单元可实现目的蛋白共表达，但存在相互干扰现象;构建了可介导在毕赤酵母和汉逊酵母中穿梭表达的通用载体系统。研究通过启动子的合理应用，实现了HPV16 L1高效表达，有助于低成本、多价HPV疫苗研发;此外，为基于酵母系统的基因重组蛋白的表达与制备提供了一种有效的优化策略。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 实现病毒样颗粒的高效制备有助于降低疫苗成本、促进推广应用

1．1．1 HPV引起的子宫颈癌危害严重

1．1．2 HPV疫苗研究进展

1．2 甲醇酵母系统是应用广泛的异源蛋白表达系统，在HPV病毒样颗粒制备中具有诱人前景

1．2．1 毕赤酵母表达系统

1．2．2 汉逊酵母表达系统

1．2．3 HPV L1在酵母中的表达研究

1．3 毕赤酵母启动子在异源基因表达中应用的研究进展

1．4 本课题主要研究内容、目的及意义

1．4．1 研究主要内容

1．4．2 本研究的目的及意义

第二章 利用毕赤酵母翻译延伸因子1-a启动子在毕赤酵母中表达异源蛋白

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 PCR扩增TEF1-a启动子、GFP基因和HPV16 L1基因结果

2．3．2 重组质粒酶切鉴定

2．3．3 GFP的表达

2．3．4 毕赤酵母在不同碳源培养基中的生长曲线

2．3．5 HPV16 L1蛋白的表达

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 甲醛脱氢酶(FLD)启动子在毕赤酵母中的应用研究

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 PCR扩增FLD启动子

3．3．2 重组质粒酶切鉴定

3．3．3 PFLD控制下GFP在毕赤酵中的表达

3．3．4 毕赤酵母在不同碳氮源诱导培养基中的生长曲线

3．3．5 不同碳氮源组合培养基中PFLD控制的HPV16 L1表达

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 联合应用AOX1启动子和TEF1-a启动子在毕赤酵母中共表达异源蛋白

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 PCR扩增HPV16 L1(M)基因结果

4．3．2 重组质粒酶切鉴定

4．3．3 重组质粒pPinkAOX1-HPV16 L1(M)／TEF1-HPV16 L1在毕赤酵母中的表达

4．3．4 重组质粒pHanAOX1-GFP在毕赤酵母重组茵pPinkTEF1-HPV16 L1中的表达

4．3．5 重组质粒pHanAOX1-HPV16 L1在毕赤酵母重组菌pPinkTEF1-HPV16 L1中的表达

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 用于异源蛋白表达的通用载体在毕赤酵母和汉逊酵母中的应用

5．1 前言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 重组质粒酶切鉴定

5．3．2 汉逊酵母rDNA及ARS元件对质粒在毕赤酵母和汉逊酵母细胞中转化效率的作用分析

5．3．3 重组质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母及汉逊酵母启动子PMOX指导下的GFP表达

5．3．4 利用毕赤酵母启动子AOX1、TEF1、FLD以及汉逊酵母启动子MOX分别在毕赤酵母和汉逊酵母中表达GFP蛋白

5．3．5 重组质粒pHanAOX1-HPV16 L1(M)和pHanMOX-HPV 16L1(M)在毕赤酵母和汉逊酵母中的穿梭表达

5．4 讨论

5．5 小结

展望

参考文献

附录

附录Ⅰ 缩写词

附录Ⅱ 主要试剂

附录Ⅲ 主要溶液的配制

附录Ⅳ 主要仪器

附录Ⅴ 基本实验操作

致谢

作者简历

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