HIV--1感染单核巨噬细胞的凋亡机制研究

摘要

目的：艾滋病严重危害着人类的健康与生命。如何清除艾滋病毒潜伏感染靶细胞一直是艾滋病研究的焦点，而单核-巨噬细胞对HIV-1感染发生凋亡抵抗，是重要的HIV-1潜伏感染靶细胞。因此，本研究探讨HIV-1感染单核-巨噬细胞的凋亡机制，为寻找清除艾滋病毒感染的单核-巨噬细胞药物及措施提供理论依据。 方法：本研究首先以THP1单核细胞和THP1源性巨噬细胞为细胞模型，用R5嗜性的HIV-1全长感染性质粒包装并获得HIV-1病毒，体外感染THP1单核细胞与THP1源性巨噬细胞，采用流式细胞仪Annexin-V/7-AAD染色检测细胞凋亡情况，进一步确认巨噬细胞对HIV-1感染的凋亡抵抗作用。采用Westernblotting方法检测巨噬细胞感染HIV-1后Bcl-2家族中促、抗凋亡分子的表达变化，明确巨噬细胞对HIV-1感染的凋亡抵抗作用与Bcl-2家族中促、抗凋亡分子的表达量间的关系。为清除HIV-1感染的巨噬细胞，本研究首先采用经典的凋亡诱导分子诱导HIV-1感染的巨噬细胞凋亡。然后，利用流式细胞仪Annexin-V/7-AAD染色和线粒体膜电位损失检测Galectin-3诱导HIV-1感染巨噬细胞凋亡，并从艾滋病恒河猴模型分离获得的巨噬细胞加以验证。 在前期基础上，本研究深入探索Galectin-3诱导HIV-1感染单核-巨噬细胞的凋亡机制，通过采用不同的Caspase抑制剂、检测Caspase-3底物PARP和检测Caspase-3的切割活性等方法对细胞凋亡的Caspase通路分析。采用Westernblotting方法检测Galectin-3诱导HIV-1感染的巨噬细胞凋亡前后促、抗凋亡分子的表达变化、细胞色素C的表达变化及Caspase非依赖性的细胞凋亡通路中的AIF与EndoG的表达变化。 此外，我们采用基因沉默技术对人单核巨噬细胞株U937的90K/Mac-2BP基因沉默，从而阐明90K/Mac-2BP对HIV-1感染单核巨噬细胞凋亡的影响。 结果：本文首先再次确认了THP1源性巨噬细胞对HIV-1感染的凋亡抵抗作用，即HIV-1感染单核细胞，对照组和感染组凋亡率分别为:(6.99±0.54)％，(28.82±1.03)％，结果具有显著差异，而HIV-1感染THP1源性巨噬细胞对照组和感染组凋亡率分别为:(5.42±0.47)％，(7.91±0.49)％，结果无显著差异。此外，本研究首次发现Galectin-3能够诱导单核细胞凋亡，凋亡率分别为:对照组(6.13±0.70)％，加入Galectin-3后(20.46±0.62)％，结果具有显著差异。更为重要的是，本研究发现Galectin-3能够诱导HIV-1感染的巨噬细胞凋亡，其中未感染组细胞加入Galectin-3前后的凋亡率分别为:(5.31±0.18)％，(11.2±0.32)％。而HIV-1感染组细胞加入Galectin-3前后的凋亡率分别为:(15.56±1.56)％，(29.78±1.94)％，结果具有显著差异。 在此基础上，我们证实了Galectin-3诱导的单核细胞(THP1)与HIV-1感染的巨噬细胞（THP1-MACs HIV-1+）凋亡与Caspase通路无关，与促凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL)无关，也与线粒体事件相关的细胞色素C(Cyto C)和凋亡诱导因子(AIF)无关，而是与核酸内切酶G(Endo G)的核转移密切相关。 另外，本研究结果显示正常人单核巨噬细胞株U937，经HIV-1感染后细胞凋亡率为(16.27±0.30)％，而90K/Mac-2BP基因沉默后的U937细胞，经HIV-1感染后细胞凋亡率分别增加至(31.26±0.35)％、(25.76±030)％、(23.69±0.33)％，具有统计学差异。 结论：本研究发现Galectin-3能够诱导HIV-1感染单核-巨噬细胞凋亡及其机制与EndoG的核转移相关，同时发现作为Galectin-3配体的90K/Mac-2BP分子基因沉默后能增强HIV-1感染单核-巨噬细胞的凋亡，这为探寻清除HIV-1感染单核-巨噬细胞的措施提出了新的理论依据，并从清除艾滋病毒潜伏感染靶细胞的角度为研发艾滋病治疗的新药提供线索。

目录

英文缩写词

摘要

第一部分 Galectin-3依赖Endo G核转移诱导HIV-1感染的巨噬细胞凋亡

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 THP1单核细胞经PMA刺激分化为巨噬细胞(THP1-MACs)

2 HIV-1感染单核、巨噬细胞的鉴定

3 HIV-1感染对单核细胞与巨噬细胞凋亡的影响

4 HIV-1感染巨噬细胞中促、抗凋亡分子表达变化

5 凋亡诱导分子对单核细胞与巨噬细胞凋亡的影响

6 Galectin-3诱导HIV-1感染的巨噬细胞凋亡

7 Galectin-3诱导SIVmac251感染的恒河猴巨噬细胞凋亡

8 Galectin-3诱导单核细胞及HIV-1感染巨噬细胞凋亡的Caspase途径分析

9 Galectin-3诱导单核细胞及HIV-1感染巨噬细胞凋亡通路的相关分子检测

讨论

参考文献

第二部分 90K／Mac-2BP基因沉默增强HIV-1感染的单核巨噬细胞凋亡

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 利用荧光定量PCR检测U937细胞90K／Mac-2BP mRNA的表达

2 Western blotting检测U937细胞90K／Mac-2BP蛋白的表达

3 HIV-1感染90K／Mac-2BP基因沉默的U937细胞凋亡增加

讨论

参考文献

总结

文献综述——半乳糖凝集素(Galectin)与HIV相关性研究进展

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