巯基化壳聚糖衍生物杂化材料及纳米药物载体的研究

摘要

壳聚糖是自然界已确定的唯一碱性多糖，具有良好的生物相容性、低毒性、可降解性、抗菌性、低免疫原性、性质稳定等优点。对壳聚糖进行亲水改性可获得具有两亲性的壳聚糖衍生物，其在水介质中能够自聚集形成纳米粒，应用于构建杂化纳米粒子和抗肿瘤药物载体引起了研究者的极大兴趣。 本论文选择聚乙二醇和聚乙烯亚胺为亲水基团，合成了两亲性壳聚糖衍生物(CS-PEG-PEI)，制备了其自聚集纳米粒，进一步体外评价了其作为疏水药物载体的可能性;同时，构建了一种低毒性、生物相容性好的壳聚糖基纳米金杂化材料，并研究了其生物相容性。主要研究工作如下: 1.合成了不同PEG取代度、不同PEI取代度的壳聚糖衍生物。首先，合成了双羧基聚乙二醇及部分巯基化聚乙烯亚胺，并进行结构表征。以壳聚糖、双羧基聚乙二醇和部分巯基化聚乙烯亚胺为原料，通过NHS/EDC催化法分别合成了壳聚糖-PEG衍生物和壳聚糖-PEG-PEI衍生物，通过1H NMR和FT-IR进行结构表征，分别探讨了壳聚糖-PEG衍生物和壳聚糖-PEG-PEI衍生物合成过程中投料比对各步产物取代度的影响，发现随着双羧基聚乙二醇和部分巯基化聚乙烯亚胺投料比例的增加取代度均增大，得到了一系列壳聚糖衍生物。 2.通过透析法制备了CS-PEG-PEI自聚集纳米粒，并利用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和动态激光粒度分析仪(DLLS)对纳米粒的形态、粒径和粒径分布进行了表征。研究结果表明，制备的CS-PEG-PEI纳米粒在水介质中能自聚集成纳米粒，且该纳米粒成球形，粒径为157.9-233.1 nm。通过纳米粒理化性质的比较分析，优选出制备纳米粒的最佳壳聚糖衍生物PEG取代度为24％，PEI取代度为3.4％。 3.通过晶种生长法合成金纳米棒(GNRs)，并通过UV-vis光谱及TEM进行了表征。采用两种方法将CS-PEG-PEI纳米粒与GNRs通过Au-S键偶联:(1)两者的混合液在探头超声作用下进行偶联得到GNRs镶嵌于纳米粒表面的分散性好、粒径均一的球形CS-GNRs杂化材料(CS-GNRs)，且GNRs与纳米粒的结合率较高;(2)两者的混合液在搅拌条件下进行偶联，也可得到球形CS-GNRs杂化材料，但是所得到的杂化材料中GNRs结合率相比于上一种方法低。综合考虑产物稳定性、GNRs结合率、粒径等方面，选择第一种方法制备的杂化材料用于下一步研究。细胞毒性实验表明未修饰的GNRs在很低浓度便对细胞表现出了很强的毒性作用，与CS-PEG-PEI纳米粒偶联后可以有效改善纳米金棒的生物相容性。 4.选择疏水性药物阿霉素(DOX)作为模型药物，采用透析法制备了载药纳米粒(CS-DOX)，并考察了载药纳米粒的理化性质及体外释放行为。研究结果表明，CS-DOX纳米粒呈球形，随着药物与载体投料比的增加，载药量增加，包封率减小;CS-DOX纳米粒在酸性介质中对阿霉素的释放速率大于中性介质，且具有一定的缓释作用。CS-PEG-PEI自聚集纳米粒及载药纳米粒的体外细胞毒性实验结果表明，空白纳米粒在浓度为200μg/mL时仍无明显细胞毒性，而载药纳米粒对人宫颈癌细胞（HeLa细胞）的生长具有明显的抑制作用。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜研究结果表明，孵育2 h HeLa细胞对载药纳米粒的摄取强于游离阿霉素，游离阿霉素主要分布于细胞核，而载药纳米粒则分布在细胞浆中。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 壳聚糖在药物传递系统中的应用

1．1．1 壳聚糖作为化学药物载体

1．1．2 壳聚糖作为蛋白质类药物载体

1．1．3 壳聚糖作为基因载体

1．2 纳米金杂化材料与生物医学

1．2．1 纳米金-多糖杂化材料

1．2．2 纳米金-核酸杂化材料

1．2．3 纳米金-蛋白杂化材料

1．2．4 纳米金其他杂化材料

1．3 课题的提出及研究思路

1．3．1 课题的提出

1．3．2 研究思路

参考文献

第二章 巯基化壳聚糖衍生物自组装纳米球的制备与表征

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器和设备

2．2．3 聚乙二醇基壳聚糖(CS-PEG)的合成

2．2．4 壳聚糖-PEG-PEI衍生物(CS-PEG-PEI)的合成

2．2．5 自组装纳米球的制备

2．2．6 产物的表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 壳聚糖衍生物的1H核磁共振表征

2．3．2 壳聚糖衍生物的FT-IR表征

2．3．3 壳聚糖衍生物中PEI取代度的计算

2．3．4 壳聚糖衍生物纳米球的制备与表征

2．4 小结

参考文献

第三章 壳聚糖基纳米金杂化材料制备与表征

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器和设备

3．2．3 金纳米棒的合成

3．2．4 壳聚糖基纳米金杂化材料制备

3．2．5 HeLa细胞复苏与培养

3．2．6 细胞毒性实验

3．2．7 产物的表征

3．3 结果与讨论

3．3．1 金纳米棒的合成与表征

3．3．2 壳聚糖基金纳米棒杂化材料的制备与表征

3．3．3 金纳米棒及壳聚糖基纳米金杂化材料的细胞毒性作用

3．4 小结

参考文献

第四章 载阿霉素的巯基化壳聚糖纳米粒的制备及表征

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂

4．2．2 仪器和设备

4．2．3 载阿霉素的巯基化壳聚糖自组装纳米粒的制备

4．2．4 载阿霉素的巯基化壳聚糖自组装纳米粒的形态及粒径分析

4．2．5 载药量和包封率的测定

4．2．6 体外药物释放

4．2．7 HeLa细胞与L929细胞的复苏与培养

4．2．8 细胞毒性实验

4．2．9 HeLa细胞对游离DOX与载药纳米粒的摄取实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 载阿毒素的巯基化壳聚糖自组装纳米粒的制备及表征

4．3．2 载药量和包封率的测定

4．3．3 体外药物释放

4．3．4 空白纳米粒、载药纳米粒及游离DOX的细胞毒性作用

4．3．5 载阿霉素自组装纳米粒的体外HeLa细胞摄取的流式分析

4．4 小结

参考文献

全文总结

发表论文情况

致谢