骨关节炎关节软骨祖细胞功能活性及miRNA表达谱的改变

摘要

目的:从严重OA患者关节软骨组织中获得软骨祖细胞(CPCs)，比较关节病变损伤区和正常未损伤区CPCs的功能及miRNA表达谱式的差异，建立两者之间的相关性，进而讨论在OA疾病状态下，miRNA对CPCs功能可能的调控作用。 方法:分别从严重OA患者TKA术后废弃的股骨远端表面病变损伤区（病变组）和正常未损伤区（正常组）软骨组织中分离培养软骨细胞，利用CD105和CD166双阳标记分选获得软骨祖细胞(CPCs)，根据国际细胞治疗协会(International Societyfor Cellular Therapy, ISCT)定义的MSCs最低标准，检测细胞表面分子和成骨、成脂、成软骨三系分化能力，鉴定其多能干细胞特性;比较病变组与正常组CD105/CD166双阳CPCs占软骨细胞的比例及细胞增殖活性，通过细胞化学染色和免疫组化定性观察、real-timePCR检测成骨、成脂、成软骨相关基因定量比较两组CPCs的三系分化能力;提取病变组与正常组CD105/CD166双阳CPCs的总RNA，分离纯化miRNA，采用台湾华联人类miRNA OneArray芯片v4技术比较分析两组CPCs的miRNA表达谱，筛选差异表达的miRNA(显著差异条件为|log2(Ratio)|＞=0.8且P＜0.05)，使用hclust和TargetScan6.2对差异表达的miRNA进行GO聚类分析和靶基因预测，进而探讨miRNA对OA患者CPCs功能发挥的调控作用。 结果:利用CD105和CD166共表达双阳标记分选获得的细胞能够在体外贴壁生长，绝大部分表达CD29、CD44、CD90、CD73，几乎不表达CD19、CD34、 CD45、和HLA-DR，且具有成骨、成脂、成软骨三系分化能力。OA患者病变组和正常组CD105/CD166双阳CPCs占软骨细胞的比例分别为0.01-22.90％/4.34-35.46％，经比较，病变组CPCs的比例较正常组显著降低（P=0.024＜0.05），进一步比较两组CD105/CD166双阳CPCs的细胞增殖活性发现，病变组CPCs较正常组细胞增殖速度显著降低，增殖活性显著减弱(P=0.01＜0.05);在分化能力方面，病变组CD105/CD166双阳CPCs与正常组相比:成脂诱导后油红O染色脂滴数量明显减少，PPAR-γ2 mRNA的表达明显下调，LPL mRNA的表达无明显差异，提示病变组CPCs成脂分化能力减弱;成骨诱导后茜素红染色钙结节数量明显增多，碱性磷酸酶活性明显增强，Runx2mRNA的表达明显上调，提示病变组CPCs成骨分化能力增强;成软骨诱导后Alcian blue染色和免疫组化无明显差异，Aggrecan和Sox9 mRNA的表达明显上调，提示病变组CPCs成软骨分化能力增强。通过miRNA芯片检测发现，病变组CD105/CD166双阳CPCs较正常组差异表达的miRNA共有11个，其中8个miRNA表达显著上调，分别为miR-574-5p、miR-30a、miR-100、miR-23b、miR-375、miR-4749-5p、miR-1273f和miR-5096，3个miRNA表达显著下调，分别为miR-31、miR-424和miR-199a-5p，而miR-31是所有差异表达的miRNA中差异倍数最高的（下调7.216倍）。有文献报道与MSCs的分化、迁移密切相关的miRNA分子有miR-31、miR-424、miR-199a-5p、miR-100、miR-23b和miR-375等6个，由此，病变组CPCs miR-31的显著下调可能是引起其成骨分化能力较正常组显著增强的主要原因。而上述miRNA对CPCs功能调控作用的最终确立还有待后续相关靶基因和分子通路研究的进一步完善。 结论:(1) CD105/CD166双阳细胞亚群是一类具有多能干细胞特性的CPCs。(2)OA患者关节损伤区较正常未损伤区的CD105/CD166双阳CPCs比例显著降低，增殖活性显著减弱。(3) OA患者关节损伤区较正常未损伤区的CD105/CD166双阳CPCs成脂分化能力减弱，成骨和成软骨分化能力增强。(4) miR-31表达的显著下调可能是引起OA患者关节损伤区CPCs成骨分化能力显著增强的主要原因，而后者导致了CPCs分化谱的异常改变，在OA的发生发展过程中可能发挥重要作用。

目录

摘要

前言

材料和方法

1．材料

2 实验方法

实验结果

1．软骨细胞与CD105／CD166双阳软骨祖细胞(CPCs)的分离培养

2．流式细胞仪检测CD105／CD166双阳细胞表面分子

3．软骨细胞中CD105／CD166双阳CPCs比例的比较

4．CD105／CD166双阳CPCs增殖活性的比较

5．CD105／CD166双阳CPCs成脂分化能力的比较

6．CD105／CD166双阳CPCs成骨分化能力的比较

7．CD105／CD166双阳CPCs成软骨分化能力的比较

8．CD105／CD166双阳CPCs miRNA芯片分析

讨论

结论

参考文献

附录一 英文缩略词表

附录二 差异表达的miRNA靶基因预测表

综述 骨关节炎组织内源性间充质干细胞的功能改变

参考文献

致谢

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