与NbnCNS-del小鼠小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA的鉴定与分析

摘要

奈美亨氏综合症(Nijmegen breakage syndrome，NBS)，是人类罕见的染色体断裂综合征，由NBS1基因的多型性突变引起，常累及中枢神经系统导致患者头小畸形。中枢神经特异性敲除Nbn基因的小鼠，具有类似NBS患者头小畸形的表型，其小脑发育缺陷尤为明显。为了鉴定新的参与Nbn缺失导致小脑功能缺陷的长非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），并研究其对小脑发育的影响，我们利用芯片技术分析野生型（NbnCNS-ctr）及Nbn神经元特异性敲除（NbnCNS-del）小鼠小脑中lncRNA的表达差异;利用实时定量PCR技术对芯片结果加以验证;针对目的lncRNA，检测其全身表达及小脑发育过程中的表达模式;利用小脑原代培养细胞及P19/Neuro2a细胞系分析该基因的细胞内定位，及对母基因的表达调控模式和（或）对神经细胞分化的影响。
　　研究结果表明，长链非编码RNA Gm15577由Negr1基因（Neuronal growthregulator1）内部的内含子区反向转录而成，特异性表达于小脑，且在小脑发育过程中呈动态变化趋势，而Nbn缺失之后Gm15577整体表达水平显著降低;同时与未分化期比较，分化后的体外小脑神经前体细胞Gm15577及其母基因Negr1均有显著升高;Gm15577敲低之后导致Negr1以及小脑增殖分化相关因子Shh与β-catenin在RNA水平的表达显著下调;人髓母细胞瘤临床样本数据分析表明NEGR1基因在正常人群与肿瘤患者之间有显著的表达差异。
　　同时研究发现，1700020I14Rik定位于细胞浆中，有较高的物种保守性，在小脑中表达含量最为丰富;在体外小脑神经前体细胞分化过程中，1700020I14Rik与神经元标记物βⅢ-tubulin的表达模式一致;并且在RA诱导的P19细胞向神经细胞分化的过程中表现出促进细胞分化的作用;此外，1700020I14Rik的第三个外显子中最保守的一段长为196 nt的序列上预测到多个miRNA靶向结合位点，这可能与1700020I14Rik发挥生物学功能的机制相关。
　　综上所述，本研究从神经特异性敲除Nbn基因小鼠模型出发，首次报道了两个新的与小鼠小脑发育相关的lncRNA Gm15577和1700020I14Rik。初步研究结果表明Gm15577通过调控Negr1进而影响小脑神经元增殖与分化进程中的Shh与β-catenin信号通路，其基因行为异常有可能与髓母细胞瘤发病有一定的相关性;1700020I14Rik参与神经元前体细胞分化过程，并具有促进神经细胞分化的作用。本研究初步证实了lncRNA Gm15577和1700020I14Rik在中枢神经系统发育过程中有重要作用。