致病细菌三型分泌系统(T3SS)高度保守的ATPase结构与功能研究

摘要

细菌编码的三型分泌系统(T3SS)通常是致病性和毒力的根源。适当的环境因素可激活T3SS编码基因的表达，从而启动了结合在双层细胞膜上的巨大针状复合物的组装以及各种效应蛋白的运输。T3SS分泌的效应蛋白包括大量的毒力因子。这些毒力因子可通过针状复合物直接输送至宿主细胞内，从而发挥裂解细胞，干扰细胞功能等作用，最终产生致病。因此，T3SS被认为是抗毒力类抗感染药物设计的理想靶标。
　　T3SS组装的针状复合物的核心元件之一是高度保守的ATPase，T3SS ATPase组装成环状同源六聚体，位于针状复合物的基底。其功能包括效应蛋白的识别，并利用ATP水解的能量将效应蛋白运输至针状复合物的中央隧道，实现向胞外的分泌。以往的研究表明，T3SS ATPase具有和F-type或V-type ATP合成酶高度同源的空间结构，因此暗示了T3SS ATPase使用与F-type或V-type ATP合成酶相似的机制驱动蛋白质底物的输送。为证明这一假说，结构生物学研究揭示了T3SS ATPase单体具有和ATP合成酶异源六聚体中β亚基相似的拓扑结构，然而由于T3SS ATPase高度的不稳定性，六聚体的结构始终缺乏高分辨率结构数据支持。T3SS ATPase六聚体组装的唯一实验证据来自HrcN蛋白的电镜研究。然而基于分辨率的局限，电镜结构无法提供六聚体组装，NTP结合及底物运输等结构细节。
　　为揭示三型分泌系统ATPase底物结合的特异性以及其参与效应蛋白输出的分子机制，本课题结合结构生物学、生物物理及生物化学和细菌学等多学科手段对痢疾杆菌T3SS ATPase Spa47及沙门氏菌T3SS ATPase InvC进行了系统的研究。首先，通过等温滴定的方法(ITC)测量了Spa47及InvC特异性结合不同核苷酸ATP，AMPPNP，ATPγS和ADP的能力。发现ATPγS的结合活性最接近天然底物ATP的结合活性，然而广泛使用的ATP类似物AMPPNP的结合能力仅与产物ADP的结合能力相当。为了进一步揭示T3SS ATPase的底物识别特异性的结构基础，我们分别解析了缺失N-端膜结合区和β-barrel结构域的Spa47和InvC的晶体结构及其与各种不同核苷酸形成的复合物晶体结构，分别为Spa47Δ1-83-ATPγS，Spa47Δ1-83-AMP-PNP, Spa47Δ1-83-ADP和 InvCΔ1-83-ATPγS,InvCΔ1-83-AMP-PNP，InvCΔ1-83-ADP。晶体结构分析揭示Spa47和InvC由典型的α/β Rossmann fold和C端螺旋束(helical bundle)结构域组成，与其他T3SS ATPase结构相似，验证了这类ATPase在结构上的保守性和酶学活性机制的相似性。在T3SSATPase与核苷酸结合的复合物结构中，仅有ATPγS和辅酶镁离子与Spa47或InvC的活性中心完全结合，因而揭示了T3SS ATPase识别ATP的结构基础。Apo T3SSATPase与各种核苷酸复合物晶体结构的比对分析确定识别ATP关键分子间作用力为P-loop与连接β和γ磷酸集团之间氧原子的氢键。由于在AMPPNP中β和丫磷酸集团之间氧原子被氮原子取代，不支持氢键的形成，这些发现解释了AMPPNP的结合能力与缺失γ磷酸集团的ADP类似。通过对Spa47和InvC结合ATPγS复合物晶体结构的深入分析，我们进而发现核苷酸的结合引起了一系列位于活性中心的构象变化，这种构象变化继而传导至下游的β9-α8 loop。β9-α8 loop位于T3SS ATPase六聚体中央隧道内部，直接参与了效应蛋白的运输。
　　综上所述，本研究首次解析了T3SSATPase与核苷酸和催化镁离子复合物的晶体结构，提供了识别ATP的结构基础。我们的结果确定了T3SS ATPase识别核苷酸的关键位点，为核苷酸类抑制剂设计提供了依据。本研究发现了ATP结合引起的构象变化可导致参与效应蛋白输送的β9-α8 loop的构象变化，从而暗示了ATP水解活性与效应蛋白输送之间的关联，为了解T3SSATPase功能机理提供了线索。三型分泌系统是细菌毒力研究的核心科学问题之一，ATPase也是生物学家感兴趣的药物设计的重要靶标，ATPase与底物ATPγS的共晶体结构为以三型分泌系统ATPase作为药物靶点提供了思路，为防治革兰氏阴性的感染的药物设计提供了结构生物学证据。

目录

声明

摘要

引言

1．三型分泌系统的基本概况

2．T3SS ATPase的研究进展

3．小结

本课题拟解决的科学问题

本课题的研究内容和意义

1．T3SS的ATPase蛋白结构生物学研究

2．T3SS的ATPase蛋白的生物物理及生物化学的研究

1．材料

1．1 菌株

1．2 ATP及其底物类似物

1．3 质粒

1．4 常用试剂和耗材

1．5 常用溶液

1．6 常用仪器和设备

2．方法

2．1 质粒构建

2．2 蛋白表达与纯化

2．3 蛋白最适溶液的确定

2．4 Spa47／InvcΔ1-83酶活性测定

2．5 Spa47／InvcΔ1-83与ATP及其类似物的结合试验

2．6 晶体的初筛

2．7 晶体优化

2．8 ATPase与ATP底物类似物共结晶实验

2．9 晶体浸泡底物

2．10 晶体数据收集与结构解析

3．结果

3．1 三型分泌系统ATPase同源比对分析

3．2 重组蛋白及其功能截短体蛋白表达与纯化

3．3 Spa47具有水解活性

3．4 Spa47单体选择性结合ATP类似物

3．5 Spa47蛋白在溶液中的构象

3．6 Spa47蛋白晶体学研究

3．7 Spa47晶体整体结构

3．8 三型分泌系统ATPase的结构比较

3．9 Spa47Δ1-83与底物类似物共晶体结构揭示底物结合的特异性

3．10 Spa47Δ1-83与ATPγS复合物结构决定核苷酸的特异性识别

3．11 Invc与底物ATPγS晶体结构与Spa47与ATPγS晶体结构比较

3．12 核苷酸的结合引起构象变化

3．13 三型分泌系统ATPase功能性突变研究

4．讨论

4．1 三型分泌系统ATPase与F／V型ATPase结构相关而功能与转位酶类似

4．2 三型分泌系统ATPase寡聚化

4．3 三型分泌系统ATPase以瞬时多聚体形式发挥活性

4．4 三型分泌系统ATPase的底物结合

4．5 三型分泌系统ATPase与ATPγS共晶体结构与小分子抑制剂的设计

4．6 三型分泌系统ATPase C端结构域结合伴侣蛋白特性

4．7 三型分泌系统ATPase N端结构域定位(胞质或膜)

4．8 介导六聚体模型的其它重要氨基酸

4．9 三型分泌系统ATPase的构型

5．结论

6．展望

参考文献

附录

致谢

个人简历及发表文章