MicroRNA-30b在胃癌中的功能及新辅助化疗应用于进展期胃癌的研究

摘要

背景:早期诊断困难、化疗耐药、缺乏有效的预后指标是目前胃癌研究领域的重要难题，限制了胃癌患者昀总体预后。寻找新的诊断标记物，深入了解胃癌发生、发展机制，逆转化疗耐药是改善胃癌患者预后的重要手段。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，在肿瘤发生、发展、增殖、侵袭、转移及化疗耐药等多个方面发挥重要作用。MiR-30b在结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤中表达降低，参与多种肿瘤生物学表型的调控。但是其在胃癌中的表达水平、调控作用及机制尚不明确。因此，检测胃癌中miR-30b的表达水平，深入研究miR-30b的调控作用及机制，对于明确其在胃癌诊断、判断预后等方面具有重要的意义。
　　新辅助化疗作为肿瘤综合治疗的一部分，已经逐渐被引用至局部进展期胃癌的治疗上。新辅助化疗应用于胃癌的手术之前，具有以下优点:提高切除率，降低肿瘤的分期，相比于单纯手术，还可以减少淋巴结和血管的转移。术前患者的营养状况良好，可以更好的耐受化疗的副反应。近年来，国内外关于胃癌新辅助化疗的研究都显示新辅助化疗有明显的效果。但是，新辅助化疗方案没有统一的标准，化疗药物、化疗周期的选择及疗效评价的时间都存在争议。
　　目的:
　　(1)探讨血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)及糖类抗原50(CA50)联合检测在胃癌患者诊断、临床病理因素及预后判断的价值。
　　(2)探索miR-30b对胃癌细胞株增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性表型的调控作用。明确miR-30b的调控的靶基因及信号通路。
　　(3)评估进展期胃癌患者行新辅助治疗后的临床病理特征及效果。评估空肠穿刺置管早期肠内营养支持治疗对接受新辅助化疗并手术胃癌患者的营养状况和并发症的影响。
　　方法:
　　(1)收集181例于我院行手术治疗的胃癌患者临床资料，回顾性分析其术前血清CEA、CA19-9、CA242及CA50的水平。通过ROC曲线，对四项肿瘤标志物单独和不同组合方式诊断胃癌的敏感性进行比较分析。单因素及多因素生存分析探讨肿瘤标志物与患者术后病理及生存预后的关系。
　　(2)通过实时定量PCR法检测miR-30b的表达水平;CCK8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;western blot检测蛋白表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-30b的靶基因。
　　(3)分析2007年2月至2015年3月于北京协和医院收治接受术前化疗和手术的115例胃癌患者的临床病例资料，所有患者采用Xelox化疗方案，奥沙利铂130mg/m2静脉滴入＞2h，第一天;口服卡培他滨1000mg/m2，第1-2周，后休息一周。三周为一疗程，患者至少接受2周期的术前化疗。评估新辅助化疗的疗效、毒副反应及与患者预后的关系。通过检测临床及实验室指标，评估空肠穿刺置管肠内营养对胃癌患者术后营养状况及并发症的影响。
　　结果：
　　(1)肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA242及CA50检测胃癌的阳性率分别为17.67，17.12，20.44和13.81％。四项肿瘤标志物联合检测的阳性率为36.57％。术前血清CEA、CA19-9、CA242和CA50升高的胃癌患者，其肿瘤临床分期也较晚，并且有较差的总生存率。术前血清CEA、CA19-9、CA242和CA50升高的胃癌患者，5年生存率分别为28.12，25.83，27.02和24.05％，而术前此四项肿瘤标志物正常的患者5年生存率则分别为55.01，55.37，56.36，54.51％(P＜0.01)。Cox比例风险模型行多因素分析示升高的CA242可作为判断胃癌预后差的独立因素。
　　(2)miR-30b表达水平在胃癌组织中明显下降。miR-30b低表达与淋巴结转移密切相关，miR-30b在23对胃癌组织中的表达与患者的年龄、性别和Lauren分型无明显相关性。
　　(3)CCK-8实验结果显示，过表达miR-30b可明显抑制胃癌细胞的生长。相反，将miR-30b inhibitor转染至胃癌细胞降低miR-30b的表达，结果显示明显促进了胃癌细胞生长。流式细胞仪检测了miR-30b对于胃癌细胞凋亡的影响，表明过表达miR-30b可以诱导胃癌细胞的凋亡。在胃癌细胞中过表达miR-30b，可以显著的抑制穿过小室孔膜的细胞数，抑制胃癌细胞侵袭迁移能力。相反，转染inhibitor下调miR-30b在胃癌细胞的表达水平，则促进了胃癌细胞的侵袭转移。
　　(4)通过构建包含种子区的野生型和突变型双萤光素酶报告基因载体，并分别与miR-30b mimics或mimics control共转染293T细胞，发现共转染mimics与野生型载体的细胞的荧光素酶活性显著低于共转染mimics与突变型载体，mimics control与野生型载体，提示EIF5A2是miR-30b的直接靶基因。
　　(5)miR-30b可能通过下调EIF5A2进而激活上皮间质转化的相关指标E-cadherin和β-catenin，抑制了肿瘤细胞的侵袭转移。
　　(6)对新辅助化疗并行手术治疗的患者进行分析，完全缓解(CR)2例，部分缓解(PR)55例，稳定(SD)47例，进展(PD)有11例，化疗有效率为49.6％，疾病控制率为90.4％。术前T分期的降期率为48.7％。化疗后最常见的不良反应为白细胞减少(16.5％)和胃肠道反应(12.2％)，多为Ⅰ-Ⅱ度。经过对症治疗后均可得到缓解。接受新辅助化疗和手术的患者中位生存期48个月，5年生存率42.4％。化疗疗效为PR的患者生存期明显优于SD和PD的患者，差异具有统计学意义(P＜0.001)。GPS评分(Glasgow prognostic score)较低的患者对于术前化疗有较好的缓解(P=0.028)。多因素回归比例模型分析显示化疗反应性(P=0.026)、肿瘤pTNM分期(P=0.037)、Lauren分型(P=0.033)和GPS评分(P=0.002)为新辅助化疗胃癌患者预后的独立因素。
　　(7)术后第3、7天，置管的肠内营养组白蛋白水平要高于不置管的肠外营养组患者;术后第3天，前白蛋白水平在置管组要高于不置管组。经空肠穿刺管营养可以促进患者早日排气，并且对肝功能具有保护作用。两组患者的生存期尚未观察到明显差别。
　　结论:
　　(1)联合检测CEA、CA19-9、CA242和CA50可以提高胃癌诊断的阳性率。CA242有较高的诊断价值。在可切除的胃癌患者中，术前的CA242与胃癌的分期有关，其是胃癌患者预后的独立预测因子;
　　(2)miR-30b在胃癌组织中及胃癌细胞中低表达;过表达miR-30b可以抑制胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡，抑制胃癌细胞的侵袭转移;
　　(3)EIF5A2是miR-30b的直接靶基因，miR-30b可能通过下调EIF5A2进而激活上皮间质转化的相关指标E-cadherin和β-catenin，抑制了肿瘤细胞的侵袭转移;
　　(4)Xelox新辅助化疗方案对于进展期胃癌患者有较好的有效率，化疗毒副反应不重。新辅助化疗后取得明显临床缓解的患者预后要好。化疗反应性、术后病理分期、Lauren分型和GPS评分可以作为新辅助化疗并手术治疗的胃癌患者预后的独立因素;
　　(5)接受新辅助化疗手术的患者经空肠营养管早期肠内营养安全方便，可以改善患者术后早期的营养状况。

目录

缩略词表

摘要

第一部分 联合检测CEA、CA19-9、CA242及C50对胃癌的诊断价值及与预后的关系

一、资料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第二部分 miR-30b在胃癌组织及细胞中的表达及对细胞表型的影响

一、实验材料和试剂

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第三部分 miR-30b生物信息学分析及靶基因的鉴定

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第四部分 新辅助化疗及空肠穿刺置管在进展期胃癌应用的临床回顾性研究

一、研究对象和研究流程

二、结果

三、讨论

四、结论

综述Ⅰ MicroRNA在胃癌转移的研究

综述Ⅱ 胃癌新辅助化疗的研究进展

参考文献

个人简历及发表论文

致谢

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