乙型肝炎病毒核心抗体IgG抑制乙型肝炎病毒复制的研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是最常见的引起人类持续感染的病毒之一，世界范围内约有20亿人曾感染过或正在感染乙型肝炎病毒，其中3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，截止到2010年的全球疾病负担研究结果显示，乙型肝炎病毒感染以每年导致约78.6万人的死亡而名列人类十大死亡原因之一。由于一些国家和地区仍然没有推广乙肝疫苗的计划免疫和疫苗无应答的不断出现，以及抗病毒药物价格昂贵，长期使用会导致严重副作用和耐药病毒株出现等原因，加之世界范围内的人口流动和慢性乙型肝炎病毒感染进展为肝硬化和肝癌高风险性，使得乙型肝炎病毒感染依然是危及世界人口健康的重要问题之一。
　　乙型肝炎病毒感染的转归主要依赖与病毒和机体免疫系统之间的相互作用。因此研究机体免疫应答对乙型肝炎病毒的清除机制，对寻求有效治疗乙型肝炎病毒感染的靶点非常重要。在对乙型肝炎病毒的研究中发现，针对乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体是感染过程中最早出现的抗体，几乎所有乙肝感染者体内都会出现而且可以在感染者体内终生存在。许多关于核心抗体单独阳性的乙肝感染者的研究显示，这些患者体内绝大部分的病毒处于低复制或隐匿感染状态。在慢性乙型肝炎病毒感染患者体内HBV处于低复制状态时，细胞免疫应答减弱，而IgG型核心抗体还持续存在。因此我们推测持续存在的核心抗体有可能抑制乙型肝炎病毒的复制导致了这种低复制状态。本研究利用纯化的人源乙型肝炎病毒核心抗体IgG处理能够稳定表达HBV病毒的HepG2.2.15细胞，对核心抗体IgG抑制细胞内HBV复制的可能机制进行了初步探讨。首先，我们利用免疫印迹技术证明核心抗体IgG能经由抗原非特异途径进入肝细胞内。其次利用激光扫描共聚焦显微镜技术和免疫印迹技术证明，进入细胞内的核心抗体IgG能够与核心抗原结合形成免疫复合物并堆积在细胞核膜的胞浆侧，从而影响核心抗体亚细胞分布。由于核心蛋白在乙型肝炎病毒复制周期中发挥着多种重要作用。那么进入细胞内的核心抗体IgG分子结合了核心抗原必然会影响到核心抗原功能的发挥，从而抑制HBV的复制。第三，我们利用化学发光微粒子免疫分析、实时定量荧光PCR技术和实时定量荧光逆转录PCR技术对给予核心抗体处理96小时的HepG2.2.15细胞培养上清中的乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原，HBV DNA和细胞内HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)和前基因组RNA(pgRNA)的浓度进行了测定。结果显示:相对于对照组，核心抗体处理组72小时后表面抗原、e抗原以及细胞内的pgRNA出现显著下降，并具有明显的时间剂量依赖性。与对照组相比，核心抗体IgG处理组培养上清中的HBV DNA72小时时出现小幅上升，96小时出现显著下降。而细胞内的HBV cccDNA水平在96小时内都没有出现显著改变。
　　本研究首次发现乙型肝炎病毒核心抗体IgG除了作为经典的乙型肝炎病毒感染的血清学标志物外，还能够抑制细胞内乙型肝炎病毒的复制。并初步证明了进入肝细胞的核心抗体抑制病毒复制的机制可能是通过干扰核心蛋白在病毒复制中的作用来实现的。本课题为更全面的了解乙型肝炎病毒与机体免疫系统相互作用以及乙型肝炎病毒感染慢性化提供了一个新的角度。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．1．1．仪器

1．1．2．主要实验耗材

1．1．3．细胞系和质粒

1．1．4．主要实验试剂

1．1．5．培养基和溶液的配制

1．2．方法

1．2．1．乙型肝炎病毒核心抗体IgG纯化与鉴定

1．2．2．乙型肝炎病毒核心抗体IgG进入肝细胞能力验证

1．2．3．乙型肝炎病毒核心抗体IgG对核心蛋白亚细胞分布的影响

1．2．4．乙型肝炎病毒核心抗体IgG对HepG2．2．15细胞内HBV复制的影响

1．2．5 统计学分析

2．结果

2．1．乙型肝炎病毒核心抗体IgG纯化与鉴定

2．1．1．纯化人源HBcAb的血清标本筛选

2．1．2．乙型肝炎病毒核心抗体IgG纯化

2．1．3 乙型肝炎病毒核心抗体IgG浓度测定

2．1．4 对纯化后HBcAb效价进行测定

2．2．1．HBcAb IgG进入HepG2．2．15细胞能力验证

2．3．HBcAb对HepG2．2．15细胞内HBc的亚细胞分布的影响

2．3．1．激光扫描共聚焦显微镜验证HBcAb IgG对HBcAg亚细胞分布的影响

2．3．2．Western Blot验证HBcAb IgG对HBcAg亚细胞分布的影响

2．4．1．HBcAb IgG对HepG2．2．15细胞内HBV复制的影响

2．4．1．1 胃蛋白酶水解核心抗体分离结果

2．4．1．2 HepG2．2．15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平的检测

2．4．1．3 HBcAb IgG对HepG2．2．15细胞分泌完整病毒颗粒的影响

2．4．3．HBcAb IgG对细胞内HBV复制的抑制作用

2．4．3．1．HepG2．2．15细胞内HBV cccDNA水平的检测

2．4．3．2．HepG2．2．15细胞内HBV pgRNA水平的检测

3．讨论

参考文献

论文综述 乙型肝炎病毒核心蛋白研究现状

致谢

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