血管性血友病因子检测候选参考物质的研制及一致化相关问题研究

摘要

目的:血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)检测主要应用于血管性血友病的诊断及分型，也可用于血友病的辅助诊断，但目前vWF检测没有国际公认的参考方法，国际标准品不易获得，不同检测系统间结果的可比性较差，难以满足临床需要。为便于临床实验室实施质量改进，促进血管性血友病因子检测的一致化，本研究通过问卷调查对国内vWF检测现状及存在的问题进行分析;制备了vWF检测候选参考物质，对其进行均一性、稳定性、互通性评价、定值和室内质控试应用;对vWF抗原检测一致化相关问题（如性能验证、校准等）进行了探讨。
　　方法:
　　1.vWF检测现状的调查研究:通过设计、发放调查问卷，收集国内临床实验室开展vWF检测项目的相关检测信息，包括实验室基本信息、仪器试剂使用信息、质量控制情况以及参考区间使用情况等;将对国内实验室vWF检测的情况与国外标准的要求进行比较分析，针对性的提出改进措施。
　　2.vWF检测候选参考物质的研制与评价:对不同制备方法的关键影响因素进行研究和分析，确定最佳的制备方案。依据ISO Guide35《标准物质/标准样品的定值——通用原则和统计原理》和CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》的要求，对候选参考物质的均匀性和稳定性进行评价。依据行业标准WS/T356-2011《基质效应与互通性评估指南》对参考物质在两种主流检测系统(STAGO和IL检测系统)的互通性进行评价;依据ISO Guide35的要求，以NIBSC凝血标准品为溯源标准，采用多家实验室协作定值。将参考物质试应用于室内质控，同时检测商品质控物作为对比。
　　3.vWF抗原检测结果一致化相关问题研究:对vWF抗原定量检测系统的正确度、批内不精密度、日间精密度、携带污染率和线性进行了性能验证评价。采用新鲜临床样本对两个系统检测结果进行可比性评价，并探讨使用NIBSC凝血标准品对两个检测系统进行模拟定标，评价定标效果。
　　结果:
　　1.检测现状的调查研究:问卷调查显示，65.5％的实验室检测标本量较少(＜50个/月)，20.7％的实验室未开展室内质控，16.7％～20.0％的实验室仅进行正常水平的室内质控，44.8％的实验室对检测仪器进行了性能验证。各实验室所用参考区间的上限范围在122％～176％，下限范围在40.6％～75％。仅2家实验室对参考区间按血型分类进行了设定。大部分实验室直接使用厂家提供的参考区间。
　　2.候选参考物质的研制与评价:选取人新鲜冰冻血浆为原料，采用低温沉淀方法分离提取vWF，将低温沉淀获得的上清液与正常原料血浆按一定比例混合并调整浓度水平，然后分装成1mL/支，置于低温冷冻（-80℃）条件下保存。本研究共制备两批次候选参考物质（第一批制备物批号分别为vWF201401、vWF201402和vWF201403，vWF∶Ag浓度范围37.0％～83.5％;第二批制备物批号分别为vWF201501、vWF201502、vWF201503、vWF201504和vWF201505, vWF∶Ag浓度范围14.0％～133.5％，vWF∶A范围6.3％～118.3％）。候选参考物质vWF∶Ag检测已完成均匀性、稳定性、互通性评价、室内质量控制试应用和定值，参考物质的vWF∶A检测已完成均匀性评价，长期稳定性已观察16周。候选参考物质vWF∶Ag、 vWF∶A均匀性良好，差异无统计学意义(P＞0.05)。第一批候选参考物质的长期稳定性评价显示vWF∶Ag浓度在44周内无明显趋势性变化(P＞0.05)，长期稳定性不确定度ults为0.79％～1.20％。第二批候选参考物质（vWF∶Ag、 vWF∶A）的长期稳定性将继续观察。候选参考物质vWF∶Ag检测在STAGO和IL两种检测系统间互通性良好。第二批候选参考物质各批号vWF∶Ag定值结果为12.2％～138.9％，定值引入不确定度uchar为0.06％～0.09％。参考物质合成标准不确定度uc为1.05％～2.17％，扩展不确定度U(k=2)为2.1％～4.4％。室内质控试应用结果显示，候选参考物质vWF∶ Ag检测结果的日间不精密度CV为1.3％～2.3％，进口商品质控物vWF∶Ag检测结果的日间不精密度CV为1.2％～2.6％。
　　3.一致化相关问题研究:性能验证结果显示，正确度验证偏差范围为-0.99％～3.96％，批内精密度CV范围1.1％～1.8％，日间精密度2.9％～3.6％，携带污染率为0.0％，线性验证斜率为1.003，相关系数为1.000，各稀释度的实测值与理论值的百分偏差均在10％以内。两系统检测结果相关系数为0.953，相关性较好，偏差分布范围为-20.8％～23.7％。采用凝血标准品对两种检测系统进行模拟校准，校准前相对偏差范围-20.8％～23.7％，校准后相对偏差范围为-9.7％～13.3％;校准前绝对偏差范围-30.5％～20.9％，校准后绝对偏差范围-26.7％～24.3％。
　　结论:
　　1.问卷调查显示vWF检测存在的主要问题是缺乏vWF相关检测的标准/指南，临床实验室检测的质量控制不规范。
　　2.本研究明确了vWF检测候选参考物质的最佳制各方案，利用冰冻血浆能够制备出浓度水平可控的候选参考物质，其均匀性、稳定性及STAGO/IL系统间互通性良好，可应用于室内质量控制。
　　3.本研究所用检测系统的性能验证方案可为其他检测系统开展性能验证提供参考;不同检测系统检测结果相关性较好，但偏差较大，即使使用同一种凝血国际标准品校准，系统间检测结果差异仍较大，需要作进一步研究。

目录

摘要

前言

第一部分 国内血管性血友病因子检测现状调查研究

1 调查目的

2 调查方法

2．1 调查对象

2．2 调查方法

2．3 统计处理

3 调查结果

3．1 一般情况

3．2 检测系统相关情况

3．3 质量保证相关信息

3．4 存在的问题

4 讨论

第二部分 血管性血友病因子检测候选参考物质的研制与评价

1 目的和依据

2 器材与试剂

2．1 设备与耗材

2．2 试剂

3 方法

3．1 候选参考物质的研制

3．2 候选参考物质的评价

3．3 定值

3．4 室内质量控制试应用

4 结果与讨论

4．1 候选参考物质的研制

4．2 候选参考物质的评价

4．3 定值

5 小结

第三部分 血管性血友病因子抗原检测结果一致化相关问题研究

一 vWF∶Ag定量检测系统的性能验证

1 目的和依据

2 器材与试剂

3 方法

4 结果

二 vWF∶Ag定量检测系统的结果比对

1 目的

2 器材与试剂

3 方法

4 结果

5 讨论

三 vWF∶Ag定量检测系统的校准模式探讨

1 目的

2 器材与试剂

3 方法

4 结果

讨论

结论

参考文献

综述 血管性血友病因子的检测与标准化

附录

致谢

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