轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

摘要

轮状病毒(RV)能够引起人类、哺乳动物类、禽类腹泻，其中A组RV是引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。完整的RV共有三层衣壳，其基因组包裹在同心衣壳蛋白组成的二十面体颗粒中，由11个分节段的双链RNA组成。RVVP6蛋白位于病毒的中间层衣壳，既是病毒含量中最丰富的蛋白，也是RV的组抗原蛋白。VP6蛋白氨基酸序列具有高度保守性，并具有较强的抗原交叉反应性;RV VP4和VP7是主要的中和抗体原蛋白。VP4蛋白在病毒外壳形成刺突样结构，能独立诱导机体产生中和抗体。目前上市的RV疫苗均为减毒活疫苗，这些疫苗虽有其优势，也有一定潜在的不足，开发安全有效的新型疫苗仍具有重要意义。
　　本研究选取VP4蛋白上具有高度保守性和抗原交叉反应性的第296-313位和第381-401位氨基酸抗原表位进行重组抗原表位嵌合蛋白研究。采用基因工程技术，成功构建A组人RV TB-Chen株VP6载体蛋白，将上述两个抗原表位分别插入VP6蛋白载体基因同一位点，构建重组表达质粒，在大肠杆菌（E.coli）细胞中成功表达出两个在VP6载体蛋白表面携带有VP4中和抗原表位的重组嵌合蛋白。表达的嵌合蛋白可与相应抗体发生特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F，Wa株病毒的VP6和VP4蛋白，可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性。结果表明，所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用。本研究为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定较好基础。

目录

摘要

前言

实验材料和方法

一、实验材料

1．主要仪器

2．主要试剂

3．菌毒株，载体质粒，细胞和实验动物

二．实验方法

1．构建pETP6重组质粒并鉴定

2 pETP6v载体质粒的构建及鉴定

3．含有VP6蛋白基因不同位置上带有不同酶切位点的pETP6v载体质粒的构建

4．携带RV VP4抗原表位重组表达质粒pETP6F298S／P[8]296和pETP6F298S／P[8]381的构建及鉴定

5．重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F／P[8]296，6F／P[8]381在大肠杆菌中的表达

6．重组载体蛋白(rVP6v)和重组嵌合蛋白的纯化

7．Bradford法测定纯化蛋白的浓度

8．MA104细胞复苏与传代培养

9．RV增殖，收获

10．RV的纯化

11．动物免疫及血清抗体的制备

12．微量滴定法测wa病毒感染性滴度

13．重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F／P[8]296和6F／P[8]381免疫豚鼠血清中和抗体效价的检测

14．Western blot检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性

结果与分析

1 质粒的构建

1．1 VP6基因的扩增

1．2 携带RV VP6基因的重组表达质粒pETP6的构建及鉴定

1．3 携带外源抗原表位的重组表达质粒pETP6F298S／P[8]／296和pETP6F298S／P[8]／381的构建及鉴定

2 重组嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表达和纯化

3 纯化蛋白浓度的测定

4 RV病毒感染性滴度的测定和免疫动物血清中和抗体滴度测定

5 Western blot分析

讨论

小结

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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