表达GFP的重组肠道病毒71型在恒河猴婴猴模型中的感染机制研究

摘要

肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)是婴幼儿手足口病(hand，foot,and mouthdisease，HFMD)的主要病原体之一。近期由EV71感染引起的手足口病在亚太地区的大规模爆发，已经成为一个为社会所关注的，严重的公共卫生问题。EV71感染婴幼儿所引起的病症一般较为温和，但在少数情况下，EV71的感染可能导致病人出现重症甚至死亡，而这些重症病例通常表现为神经系统损伤的临床特征，包括无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹、脑干脑炎，并且常伴有相关的系统性症状，如严重的肺水肿和休克。由于EV71感染所导致的重症病例的原因迄今尚不清楚，因此针对感染性疾病的临床治疗和预防工作仍有许多盲点，而基于这一现状的相关感染病理机制的进一步研究，正是本次实验研究的主要目的所在。
　　研究初期以EV71的FY-23株为模板，扩增得到基因组全长cDNA并将其连接入pSP64载体中，使用体外转录体系得到EV71基因组的全长转录本，并将转录本转染Vero细胞从而得到EV71拯救病毒株。经鉴定其遗传特性、生长特性、致病性和免疫原性均与母株病毒性状基本相似。在此基础上，使用搭桥PCR技术将绿色荧光蛋白基因插入EV71的VP4基因中，获得能够稳定传代并表达绿色荧光蛋白的重组EV71病毒。利用该重组病毒在感染细胞的过程中能够表达其荧光标记的特性，我们可以在感染的恒河猴婴猴动物模型上直观地观察病毒感染部位和途径。
　　我们在前期的研究工作中，已建立了恒河猴婴猴EV71感染的动物模型，该模型已被成功应用于EV71致病机理及药物开发研究。在本次实验中，试验分别通过呼吸道攻毒（鼻腔喷雾）和肠道攻毒（饮水）两种途径，使用104.5CCID50/只的感染剂量对恒河猴婴猴进行攻毒，实验组使用的毒株为绿色荧光蛋白重组病毒，对照组毒株为具有野生表型的FY-23株。首先，我们发现两种攻毒方式均能引起婴猴体温升高和病毒血症，但呼吸道途径攻毒方式所产生的病理特征更为明显。在呼吸道攻毒的婴猴中不仅表现出手足口部的疱疹，而且伴有中枢神经系统的炎症反应和肺水肿，这一特征与人类重症病例症状极为相似。其次，从呼吸道途径感染婴猴的病理切片上观察到明显的中枢神经系统和呼吸道系统器官病理改变。另外通过两种途径感染的婴猴，其呼吸系统的病毒载量都有增加，而通过呼吸道途径感染的婴猴病毒载量升高较明显，但二者在肠道中的病毒载量均无明显增加。综上所述，呼吸道途径感染婴猴所引起的病症更为典型，因此，接下来重点研究呼吸道途径感染恒河猴婴猴的相关病理机制。
　　利用冰冻切片和免疫荧光技术，我们发现在感染初期EV71主要在呼吸道上皮细胞和淋巴结中增殖，并且在稍晚时中枢神经系统脑干部位观察到病毒发出的绿色荧光。进一步使用流式细胞术和免疫荧光共定位分析，结果表明EV71能够感染树突状细胞(dendritic cell，DC)，在不同亚群的DC中EV71偏好于感染CD141+DC。实验表明在病毒感染早期，CD141+DC被募集至感染部位并被病毒侵染。随后，DC可能搭载着病毒从最初的感染部位迁移至淋巴结，进一步随循环系统到达中枢神经系统等靶器官。EV71感染DC后能刺激其成熟，而感染过程并不影响机体的免疫反应。与此同时，恒河猴婴猴DC在体外的感染实验亦映证了以上结论。
　　综上所述，本次实验使用反向遗传学技术快速构建得到绿色荧光蛋白重组EV71病毒，利用该病毒的荧光标记观察其在恒河猴婴猴动物模型上的感染途径，从而进一步阐明EV71致病机制，尤其是DC在病毒感染进程中扮演的特殊角色。随着实验研究的深入和病理机制的进一步揭示，将为EV71感染引起重症病例的防治带来新的启示。

目录

摘要

1 前言

1．1 EV71的结构特征

1．2 EV71的复制和生活史

1．3 流行病学

1．4 病理机制

1．5 EV71感染的临床特征

1．6 EV71感染和免疫反应

1．7 EV71感染动物模型

1．8 拯救病毒构建技术

1．9 本次研究思路

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 工程菌

2．1．2 病毒

2．1．3 哺乳动物细胞系

2．1．4 质粒

2．1．5 引物

2．1．6 PCR聚合酶、酶切和连接工具酶以及其它相关试剂

2．1．7 分子量标准

2．1．8 抗体

2．1．9 转染试剂

2．1．10 试剂盒

2．1．11 其他主要试剂

2．1．12 主要耗材

2．1．13 主要设备仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 病毒的培养、滴定、浓缩

2．2．3 EV71感染性克隆的构建

2．2．4 绿色荧光蛋白重组病毒的构建

2．2．5 绿色荧光蛋白重组病毒的传代与鉴定

2．2．6 绿色荧光重组EV71(EGFP-EV71)病毒感染恒河猴婴猴的实验

2．2．7 分离外周血树突状细胞，以EGFP-EV71感染树突状细胞

3．结果与分析

3．1 构建感染性克隆

3．1．1 EV71全长cDNA感染性克隆质粒的构建

3．1．2 全长cDNA的序列测序和分析

3．1．3 重组质粒的纯化

3．1．4 线性化重组质粒pSP64 Poly(A)-EV71(1-7409)

3．1．5 体外转录

3．1．6 EV71基因组体外转录本转染Vero细胞并获得拯救病毒

3．1．7 拯救病毒特征

3．2 绿色荧光蛋白重组病毒的构建

3．2．1 绿色荧光蛋白重组病毒基因组重组质粒的构建

3．2．2 获得绿色荧光蛋白重组病毒(EGFP-EV71)

3．2．3 绿色荧光蛋白重组病毒(EGFP-EV71)生长曲线、中和实验、噬斑形态、SDS-PAGE电泳

3．3 绿色荧光重组EV71病毒(EGFP-EV71)感染恒河猴婴猴

3．3．1 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴的临床特征观察

3．3．2 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴，呼吸道感染比肠道感染所引起病理特征明显

3．3．3 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴后在呼吸道及其上皮细胞增殖

3．3．4 EGFP-EV71呼吸道感染恒河猴婴猴初期病毒载量主要分布情况

3．3．5 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴后在淋巴结中增殖

3．3．6 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴并在中枢神经系统中增殖

3．3．7 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴后出现病毒血症

3．3．8 流式细胞术分析EGFP-EV71感染恒河猴婴猴树突状细胞(DC)

3．3．9 流式细胞术分析EGFP-EV71偏好感染恒河猴婴猴CD141+DCs

3．3．10 免疫荧光共定位分析EGFP-EV71感染恒河猴婴猴树突状细胞

3．4 EGFP-EV71感染恒河猴婴猴外周血树突状细胞体外实验

3．4．1 在体外EGFP-EV71感染DC

3．4．2 体外EGFP-EV71感染CD141+DC细胞并刺激DC成熟

3．4．3 体外EGFP-EV71感染DC并分泌细胞因子

4．讨论

小结

参考文献

论文综述 肠道病毒感染及其部分感染机制研究

附录

致谢

研究生简历

声明