线粒体及其调控基因在糖脂异常发生机制中的作用

摘要

目的：
　　线粒体基因突变与线粒体DNA拷贝量减少共同参与线粒体功能障碍的发生，线粒体DNA拷贝量减少在年龄相关退行性疾病-2型糖尿病发病中起到重要的驱动性作用。本研究将从线粒体单基因突变的线粒体糖尿病家系入手，结合2型糖尿病的发病进程，探讨线粒体功能障碍与糖脂代谢异常的关系。通过建立线粒体内膜调控氧化磷酸化解偶联作用的解偶联蛋白2(Uncoupling Protein2，UCP2)基因敲除小鼠高脂饲养模型，探索UCP2及其上游调控基因在糖脂代谢中的作用，并在血糖谱连续的人群中（健康人群-糖尿病前期-2型糖尿病）分析UCP2及其上游调控基因氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome ProliferatorActivated Receptorγ，PPARγ)基因多态性特点。探寻饮食结构对线粒体功能及对位于染色体末端生物学老化的标志物-端粒长度(Telomere Length，TL)的影响，分析饮食在线粒体介导糖脂代谢异常中的作用，从遗传、环境因素两方面探讨2型糖尿病的发病机制。同时，探讨血脂比(TG/HDL-C)能否作为评估胰岛素抵抗以及胰岛β细胞分泌功能受损的临床指标，寻找预测2型糖尿病胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能的简易标志物。
　　方法：
　　人群研究对象:①线粒体糖尿病患者来自2007年4月至2015年12月间在北京协和医院内分泌科就诊的线粒体DNA3243 A＞G位点突变的线粒体糖尿病患者16例;②血糖谱连续人群来自2014年3月至2015年1月间北京农村社区2型糖尿病管理模式的建立项目共599人;③队列研究基线人群来自2005年4月-2006年4月就诊于北京协和医院门诊的76例2型糖尿病患者。收集一般人口学特征、临床、生化资料、饮食结构问卷。线粒体DNA3243位点基因突变检测采用直接测序法（Sanger法），突变位点碱基G/A峰值比定义为=碱基G峰值高度÷碱基A峰值高度。外周血线粒体DNA拷贝量、端粒长度的测定采用荧光实时定量多聚酶式反应。基因多态性分析采用质谱检测平台，检测8个UCP2功能区多态性位点(rs660339、rs659366、rs649446、rs586773、rs34408426、rs7109266、rs3019463、rs591758)，7个PPARγ功能区多态性位点(rs3856806、rs2920502、 rs17029007、rs73021485、rs73813168、rs2920503、rs79310821)。氧化应激指标（SOD、GR、8-oxo-dG）、炎症因子（IL-6、TNF-α）测定采用酶联免疫吸附法测定。
　　动物研究:C57BL/6背景的雄性UCP2-/-小鼠和同周龄C57BL/6背景的UCP2+/+小鼠。高脂饲养16周。肝脏组织基因表达谱采用全基因组表达芯片分析(Affymetrix Mouse Gene ST1.0 array)。
　　结果：
　　1.线粒体DNA3243 A＞G突变糖尿病患者临床特点及突变异质性与疾病谱间的关系
　　16例线粒体糖尿病患者（起病年龄:35.0±14.6岁）伴明确的母系遗传家族史、体型偏瘦(BMI:19.5±2.36 kg/m2)、耳聋累及高频域。线粒体DNA3243位点A＞G突变G/A峰值比与发病年龄呈显著负相关(相关系数r=-0.841，P＜0.001)。
　　2.外周血线粒体DNA拷贝量与葡萄糖刺激后胰岛β细胞分泌功能的关联分析
　　外周血线粒体DNA拷贝量与口服葡萄糖耐量后早相、总体胰岛素分泌指数呈显著性正相关，与30min、60min、120min血糖呈显著性负相关，与空腹胰岛素分泌指数、血糖、血脂并不存在显著性相关。多元线性回归分析表明，外周血线粒体DNA拷贝量减少可增加葡萄糖刺激后β细胞功能受损风险(DI30∶β=0.104，P=0.019; DI120∶β=0.116，P=0.009)。多元logistic回归分析表明外周血线粒体DNA拷贝量与2型糖尿病发生风险呈显著性负相关(OR:0.468，95％CI:0.245-0.893，P=0.021)。
　　3.UCP2在糖脂代谢中的作用及其代谢通路分析
　　持续高脂饲养状态下，UCP2-/-小鼠胰岛β细胞功能和胰岛素敏感性好于UCP2+/+小鼠，UCP2-/-小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸显著性低于UCP2+/+小鼠。根据肝脏基因芯片分析，UCP2-/-组与UCP2+/+组间，“PPAR信号通路”中7种基因表达显著性上调，包括PPARγ，Acsl3，Lpl，Me1，Scd1，Fads2。PPAR另外两种异构体—PPARα、PPAR6基因表达量在UCP2-/-组和UCP2+/+组间并不存在显著性差异。
　　4.人群UCP2-PPARγ多态性与糖脂代谢异常相关性研究
　　8个UCP2基因SNP位点等位基因、基因型在不同糖代谢状态人群间不存在显著性差异。PPARγ基因rs2920502位点等位基因碱基G、基因型GG时是糖代谢异常的保护因素(等位基因OR:0.818，95％ CI:0.526-0.969，P=0.042;基因型OR:0.715，95％ CI:0.527-0.97，P=0.031)，GG基因型血脂TC、TG、LDL-C、TG/HDL-C低于GC、CC基因。rs3856806位点等位基因碱基T、等位基因TT时是糖代谢异常的危险因素（等位基因0R:1.46，95％CI:1.055-2.017，P=0.022;基因型OR:1.58，95％CI:1.104-2.761，P=0.032）。
　　5.线粒体糖尿病与2型糖尿病、正常人群外周血DNA端粒长度比较
　　端粒长度在线粒体糖尿病、2型糖尿病组显著性低于正常对照组，但线粒体糖尿病和2型糖尿病组间并不存在显著性差异(线粒体糖尿病vs2型糖尿病vs正常对照:1.28±0.54 vs1.14±0.43 vs1.63±0.61，P=0.000)。外周血DNA端粒长度与线粒体DNA3243突变位点碱基G/A峰值比并不存在显著性相关性(r=-0.156，P=0.646)。
　　6.饮食成分、碳水化合物构成比对外周血DNA端粒长度及血糖的影响
　　糖尿病组端粒长度较正常对照组显著性缩短(log(TL):血糖正常组vs糖尿病前期组vs糖尿病组:2.01±0.03 vs1.97±0.03 vs1.89±0.03，P=0.005)。端粒长度与每日饮食总能量摄入及饮食中脂类/碳水化合物比例不存在显著性相关，多元线性回归分析表明，豆制品、坚果、鱼类、海藻类是端粒长度的保护因素，甜饮料是其危险因素(豆类:β=0.105，P=0.018;坚果:β=0.110，P=0.011;鱼类:β=0.118，P=0.007;海藻类:β=0.116，P=0.009)。饮食中脂类、碳水化合物构成比和谷类、肉类与TNF-α呈显著性正相关（脂类:r=0.119，P=0.008;碳水化合物:r=0.094，P=0.043;谷类:r=0.091，P=0.048;肉类:r=0.405，P=0.009)。海藻类、奶制品摄入量与8-oxo-dG呈显著性负相关（海藻类:r=-0.496，P=0.001;奶制品:r=-0.246，P=0.046），蔬菜、水果类摄入与GR呈显著性正相关(蔬菜:r=0.101，P=0.034;水果:r=0.125，P=0.045)。
　　7.血脂比TG/HDL-C对胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的预测作用
　　血糖谱连续的人群中，TG/HDL-C、TG可作为预测胰岛素抵抗的血脂标志(TG/HDL-C: ROC曲线下面积(AUROC):0.71，95％CI:0.66-0.75，P=0.000; TG: AUROC:0.71，95％ CI:0.65-0.75，P=0.000);诊断胰岛素抵抗TG/HDL-C、TG最佳切点值分别为:1.11，1.33mmol/L。TG/HDL-C与HOMA-β存在显著性负相关，ROC曲线下面积均小，不宜作为判断β细胞分泌受损的指标。
　　结论：
　　1.早发糖尿病患者伴母系遗传家族史、BMI正常或偏瘦、耳聋可强烈提示线粒体糖尿病的存在。外周血DNA直接测序法对线粒体DNA3243位点A＞G突变进行鉴定，其突变G/A峰值比对线粒体疾病的起病年龄及疾病严重程度可起到简单的预测作用。
　　2.在血糖谱连续的人群中，本研究首次发现，线粒体DNA拷贝量与葡萄糖刺激后的早相、总体胰岛素分泌功能呈显著性正相关，其对于餐后血糖的影响大于对空腹血糖的影响。
　　3.UCP2缺乏通过PPAR信号通路提高胰岛素敏感性和β细胞功能来改善血糖、血脂，PPARγ多态位点(rs2920502、rs3856806)与糖脂代谢密切相关，是高脂饮食状态下调控UCP2表达的重要基因。
　　4.端粒长度缩短可能参与糖尿病的发病机制，但并非线粒体糖尿病的特异性指标。饮食成分可能通过改变机体氧化应激和炎症状态影响端粒长度。
　　5.在血糖谱连续的人群中，本研究首次发现，血脂比TG/HDL-C可作为胰岛素抵抗的预测标志。TG/HDL-C与空腹β细胞分泌功能存在显著性负相关。在2型糖尿病病程中，基线时Log(TG)/HDL-C值高预示胰岛β细胞功能障碍进展较快。

目录

摘要

研究背景

第一部分 16例线粒体DNA 3243位点A>G突变的线粒体糖尿病患者临床特点及突变异质性分析

前言

研究对象和方法

研究结果

讨论

第二部分 不同糖代谢状态人群：外周血线粒体渊A拷贝量与葡萄糖刺激后胰岛β细胞分泌功能的关联

前言

研究对象和方法

研究结果

讨论

第三部分 线粒体调控基因一解偶联蛋白2(UCP2)在糖脂代谢中的作用及其代谢通路分析

前言

研究对象和方法

研究结果

讨论

第四部分 UCP2-PPARγ多态性与糖脂代谢异常相关性研究

前言

研究对象和方法

研究结果

讨论

第五部分 线粒体-端粒轴、饮食结构与糖屎病

前言

研究对象与方法

5．1 线粒体糖尿病、2型糖尿病与正常人群外周血DNA端粒长度比较

研究对象与方法

研究结果

5．2 中国连续血糖谱人群：碳水化合物构成比、饮食成分对外周血DNA端粒长度及血糖的影响

研究对象和方法

研究结果

讨论

第六部分 血脂比TG／HDL-C对胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的预测作用

前言

6．1 中国血糖谱连续人群：血脂比TG／HDL-C对胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的预测作用

研究对象和方法

研究结果

6．2 2型糖尿病患者TG／HDL-C比值对胰岛β细胞功能的预测作用：6年队列研究

研究对象和方法

研究结果

讨论

研究结论

参考文献

论文综述一 线粒体、端粒与糖尿病

论文综述二 2型糖尿病与血脂异常

缩略语表

实验器材

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