复杂体系中多目标化合物定性和定量分析技术和策略研究

摘要

复杂体系中多目标化合物的定性和定量分析一直是分析化学领域研究的难点。在药物分析领域，复杂体系分析主要包括了中草药及中药组方中有效成分或违禁物质的分析，生物样本中药物及其代谢产物以及内源性代谢物的分析等。一方面这类样本的成分和基质都很复杂，一种中草药可能就含有成千上百种化学成分，而在生物样本中更含有种类繁多数量巨大的内源性物质;另一方面很多目标化合物是微量甚至痕量的，并且结构是未知的。因此，如何从复杂体系中快速灵敏地发现并确证已知目标化合物，并且有效排除干扰发现并鉴定未知的目标化合物，以及实现对微量目标化合物的准确定量一直是近年来研究的热点。
　　本论文选择了几种常见的复杂体系样本，针对不同的分析目标进行分析技术和分析策略的探索性研究。
　　论文第一部分选择微量生物样本的代谢组学分析技术为研究目标，针对目前代谢组学研究面临的生物样本微量，但是需要高覆盖不同丰度和理化性质的内源性代谢物的需求，建立了一种新的生物样品前处理方法，该方法首先向100μl血浆或组织匀浆液中加入内标溶液和3ml甲醇/甲基叔丁基醚(1∶1，v/v)并涡旋沉淀蛋白，经离心后弃去蛋白沉淀，溶液部分加入3.5ml甲基叔丁基醚和1.2ml去离子水后涡旋萃取，脂质代谢物被萃取到有机相，极性小分子代谢物被萃取到水相，离心后分别将有机相和水相用氮气吹干后复溶。该方法可以实现从同一份微量生物样本(100μl)中同时提取并分离脂质和极性小分子内源性代谢物。在此基础上，采用对强极性化合物具有良好保留作用的亲水相互作用色谱和灵敏度高、定量准确的三重四极杆质谱联用技术新建了靶向极性小分子代谢组学的分析方法，结合实验室已有的靶向脂质组学分析方法和脂肪酸分析方法，使得生物样本经前处理后可以按照代谢物极性和丰度不同采用上述系列液质联用分析方法进行分析，形成一个新的基于微量生物样本的高覆盖靶向代谢组学分析技术平台。该平台实现了同时覆盖包括脂肪酸代谢、鞘脂代谢、磷脂和甘油酯代谢、氨基酸代谢、能量代谢和核苷酸代谢等主要代谢通路中808种代谢物的靶向分析。
　　采用该平台基于代谢组学研究了银杏类提取物（银杏叶提取物和内酯提取物）对心肌缺血损伤大鼠的心脏保护作用。结果发现银杏叶提取物和内酯提取物能够显著调节由于心肌缺血损伤造成的脂质代谢、氨基酸代谢和能量代谢紊乱，发现了血浆中5种脂肪酸、1种鞘脂、4种磷脂、9种甘油酯、8种氨基酸以及心肌中2种鞘脂、12种磷脂、1种甘油酯、7种极性小分子代谢物可以作为生物标志物，指征银杏叶提取物的心脏保护作用，发现了血浆中5种脂肪酸、10种鞘脂、2种磷脂、9种甘油酯、7种极性小分子化合物以及心肌中3种鞘脂、6种磷脂、1种甘油酯、11种极性小分子代谢物可以作为生物标志物，指征内酯提取物的心脏保护作用。这种调节作用与它们的抗氧化、抗血小板凝集和降血脂的作用有关。
　　为了进一步研究银杏叶提取物和内酯提取物发挥心脏保护作用的物质基础，进行了体外成分的分析和体内代谢产物的研究。首先建立了提取物成分和体内代谢产物的液相色谱-高分辨质谱联用技术的分析方法，该方法可以同时采集提取物和生物样本中目标化合物的高分辨质谱数据和多级质谱数据。然后经过对两种提取物和大鼠给药后尿液、粪便、血浆和心肌组织的分析，并采用质谱树状图相似度过滤技术寻找代谢物，结果在银杏叶提取物中鉴定了六大类48种成分，在银杏叶提取物给药大鼠体内发现18种原型成分和21种甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化代谢物;在内酯提取物给药大鼠体内发现3种原型成分和1种甲基化代谢物。
　　论文第二部分针对目前保健食品中违禁物质种类繁多、不断出现新的结构类似物，一种方法很难同时实现发现、确证和定量多种违禁物质的问题，选择保健食品作为研究对象，建立了一种新的基于高效液相色谱-高分辨质谱联用技术和质谱树状图相似度过滤技术(MTSF)的保健食品中违禁物质的分析策略。第一步，运用67种已知违禁物质对照品建立分析方法，该方法前处理采用甲醇超声提取，色谱柱为资生堂Capcell Core C18（50×2.1mm，2.7μm），流动相为缓冲溶液（含10mM甲酸铵和0.1％乙酸）和乙腈，梯度洗脱，流速:0.3ml/min，柱温:30℃，进样量:2μl;质谱采用线性离子阱/傅立叶变换离子回旋共振质谱仪，ESI离子源，正离子检测模式，扫描方式为全扫描以及通过数据依赖扫描模式对最强和次强的离子进行碰撞诱导解离(CID)获得三级碎片离子。然后采集每种违禁物质对照品的高分辨质谱数据、多级质谱数据和保留时间。第二步，将采集到的已知违禁物质的质谱数据生成质谱树状图，并建立违禁物质质谱树状图数据库。第三步，待测样品经甲醇超声提取后采用上述分析方法分析，分析结果首先通过保留时间和高分辨质量数进行初筛。如果样品中含有已知违禁物质，则采用MTSF技术将样品中可疑物质的质谱树状图和数据库中违禁物质的质谱树状图进行相似度比对，如果相似度得分大于950，则样品中的违禁物质得到确证。并且该违禁物质可进一步被定量。第四步，为发现样品中含有的未知违禁物质，采用MTSF技术将样品中所有物质的质谱树状图和数据库中违禁物质的质谱树状图进行相似度比对。相似度得分大于200的化合物认为是潜在的违禁物质。根据这些潜在的违禁物质的质谱树状图和精确质量数推导出其结构，通过购买或者合成对照品后，将其建立到数据库中，从而对新的违禁物质进行确证和定量。目前该策略包含抗疲劳、降糖、镇咳、镇静催眠、激素和减肥六大类67种违禁物质和结构类似物。通过测定市售的50种保健食品和中药组方制剂，证明该分析策略快速而且可靠。
　　论文第三部分针对目前蛋白同化激素类兴奋剂代谢个体差异大而且复杂，特征代谢物类型、体内停留时间和体内浓度水平具有个体差异性，阳性结果不易判断的瓶颈问题，选择服药后人体尿样作为研究对象，建立了基于高效液相色谱-多反应监测技术的兴奋剂代谢物发现新策略。首先建立了司坦唑醇及其代谢物在尿样中的分析方法，该分析方法采用甲基叔丁基醚提取Ⅰ相代谢物，固相萃取法分离Ⅱ相代谢物，色谱柱为Waters SymmetryC18(2.1×100mm，3.5μm)，流动相为0.1％甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱，流速:0.3ml/min，柱温:35℃，进样量:5μl。质谱采用三重四极杆质谱， ESI离子源，正离子检测模式，扫描模式为多反应检测(MRM)。其次，以司坦唑醇其主要代谢物的特征碎片离子作为子离子，根据可能的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应类型推测母离子，通过MRM扫描在尿样中全面寻找司坦唑醇的代谢物，特别是未知的和低浓度的代谢物。结果共发现司坦唑醇Ⅰ相代谢物27种，Ⅱ相代谢物21种，其中14种Ⅰ相代谢物和14种Ⅱ相代谢物未见文献报道，9种代谢物在停药后15天仍可在尿液中检测到。因此该策略可有效用于表征蛋白同化激素类兴奋剂的体内代谢轮廓并发现其未知和长时间停留的代谢物，延长其检测窗口期，增强对这类兴奋剂的检测能力。

目录

摘要

第一章 复杂体系中多目标化合物定性和定量分析技术和策略研究进展

1 分析技术

1．1 样品前处理技术

1．2 色谱分离技术

1．3 质谱和液质联用技术

1．4 化学计量学

2 分析策略

2．1 多种不同功能特点仪器联用

2．2 基于保留时间与结构关系建立的未知化合物定性策略

2．3 基于多级特征质谱碎片建立的未知化合物发现和定性策略

2．4 无对照品的多目标化合物定量策略

2．5 轮廓表征策略

3 展望

参考文献

第二章 基于微量生物样本的高覆盖靶向代谢组学分析技术研究和在心肌缺血损伤保护研究中的应用

第一节 基于微量生物样本的高覆盖靶向代谢组学分析平台的建立

1 仪器设备与实验材料

2 实验方法

3 实验结果和讨论

4 结论

参考文献

第二节 基于代谢组学的大鼠心肌缺血损伤和银杏类提取物的保护作用研究

一、大鼠心肌缺血损伤模型的建立和银杏类提取物的保护作用研究

二、基于代谢组学的银杏类提取物的心脏保护作用研究

参考文献

第三节 银杏叶提取物和内酯提取物成分分析与代谢产物研究

1 仪器设备与实验材料

2 实验方法

3 实验结果和讨论

4 结论

参考文献

第三章 保健食品中违禁物质同时发现、确证和定量分析新策略研究

1 仪器设备与实验材料

1．1 仪器设备

1．2 实验材料

2 实验方法

2．1 对照品溶液的配制

2．2 样品前处理

2．3 分析条件

2．4 方法学验证

2．5 已知违禁物质的初筛、确证和定量

2．6 运用质谱树状图相似度过滤技术(MTSF)进行数据处理

3 实验结果与讨论

3．1 样品前处理方法的优化

3．2 分析条件的优化

3．2 方法学验证

3．3 HPLC-HRMS／MS"结合MTSF技术进行保健食品中违禁物质的快速发现、确证和定量策略

3．4 实际样品的分析和确证

4 结论

参考文献

第四章 尿样中未知和低浓度兴奋剂代谢物发现和鉴定新策略研究

1 仪器设备与实验材料

1．1 仪器设备

1．2 实验材料

2 实验方法

2．1 对照品溶液的配制

2．2 司坦唑醇药物受试试验

2．3 样本前处理

2．4 分析条件

2．5 代谢物发现的MRM特征离子对设置

2．6 代谢物的结构鉴定

3 实验结果和讨论

3．1 样本前处理方法的优化

3．2 分析条件的优化

3．3 司坦唑醇及其主要代谢物的特征碎片离子

3．4 发现和鉴定未知和低浓度代谢物的HPLC-MRM策略

3．5 司坦唑醇长时间残留代谢物的发现

4 结论

参考文献

英文缩略词表

致谢

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