静注入免疫球蛋白Fc片段唾液酸化及其抗炎活性的初步研究

摘要

静注入免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin，IVlg）是从上千个健康献血者血浆中分离提取的免疫球蛋白混合物，包含约107种广谱抗体。IVIg最初主要用于治疗先天性免疫缺陷疾病，近三十年其在自身免疫性疾病和炎症疾病的治疗中的发挥着越来越重要的抗炎活性。近年来有一些研究认为其发挥抗炎活性的关键与其抗体可结晶段(Fragment crystallizable，Fc)糖链的唾液酸化程度密切相关，高唾液酸化的IVIg及其Fc片段在小鼠关节炎模型及免疫性血小板减少性紫癜等模型中表现出较高的抗炎活性;目前关于此方面的研究还存在争议，而国内尚无关于IVIg唾液酸化及其抗炎活性机制的研究报道。
　　目的:明确国内主要血液制品厂家IVIg的唾液酸含量;制备高唾液酸化的Fc片段及高唾液酸化的IVIg;验证IVIg及Fc片段的抗炎活性是否与其唾液酸化程度有关。
　　方法:1.分别建立分光光度法及高效液相-荧光检测法两种适合IVIg产品唾液酸含量测定的方法，比较国内厂家的IVIg唾液酸含量的差异。
　　2.通过木瓜蛋白酶酶切IVIg，蛋白G柱、分子筛柱两步柱纯化，获取Fc片段;利用西洋接骨木凝集素，富集唾液酸含量较高的IVIg和Fc片段;通过蛋白电泳及免疫印迹分析制备产物的纯度和抗体结构。
　　3.建立THP-1细胞炎症模型，验证上述制备的高唾液酸化的IVIg和高唾液酸化的Fc组分的抑制炎症因子分泌的能力，比较其抗炎活性与唾液酸化程度的关系。
　　结果:1.建立的两种唾液酸含量的测定方法均可以应用于与本试验对IVIg及Fc片段的测定;两种方法各有不同优劣之处;国内厂家的IVIg制品唾液酸糖基含量范围在2.75-4.52μg/mg IgG，约合每分子IgG含有1.42-2.34个唾液酸糖基，部分厂家之间存在显著性差异。
　　2.蛋白电泳及免疫印迹分析显示，通过多步骤纯化制备的高唾液酸化的Fc片段具有良好的纯度和抗体活性。
　　3.在诱导的THP-1细胞炎症模型中，1mg/mL培养终浓度的IVIg具有良好的抑制两种炎症因子TNF-α、IL-6分泌的能力;高唾液酸化的IVIg及Fc片段相比于同浓度未富集唾液酸的IVIg和Fc片段显示高出2-5倍不等的抑制炎症因子分泌的能力;
　　结论:国内主要厂家IVIg制品唾液酸含量在2.75-4.52μg/mg IgG之间，部分厂家的制品唾液酸含量存在显著性差异。IVIg在THP-1细胞诱导的炎症模型中具有较好的抗炎活性，高唾液酸化的IVIg和Fc片段具有更强的抗炎活性，并且其抗炎活性与其Fc片段的唾液酸化程度有关。

目录

摘要

前言

第一章 我国主流血液制品厂家市售IVIg制品唾液酸化水平差异

1 材料与仪器

1．1 试剂材料

1．2 仪器设备

2 方法

2．1 高效液相色谱检测IVIg制品唾液酸化水平

2．2 间苯二酚法检测IVIg制品唾液酸化水平

3 结果

3．1 高效液相色谱检测lVIg制品唾液酸化水平结果

3．2 间苯二酚法检测IVIg制品唾液酸化水平结果

4 讨论

第2章 唾液酸化的IVIg Fc片段的制备

1 材料与仪器

1．1 试剂材料

1．2 仪器设备

2 方法

2．1 木瓜蛋白酶酶切IVIg

2．2 蛋白G柱亲和层析

2．3 分子筛层析

2．4 西洋接骨木凝集素富集唾液酸化的Fc片段

3 结果

3．1 木瓜蛋白酶酶切条件优化结果

3．2 蛋白G柱纯化产物

3．3 分子筛层析产物

3．4 西洋接骨木凝集素富集产物

4 讨论

第3章 IVIg Fc片段唾液酸化对炎症因子表达的影响

1 材料与仪器

1．1 试剂材料

1．2 仪器设备

2 方法

2．1 THP-1细胞炎症模型的建立

2．2 IVIg在细胞炎症模型中对炎症因子表达的影响

2．3 唾液酸化的Fc片段在细胞炎症模型中对炎症因子表达的影响

3 结果

3．1 THP-1细胞炎症模型验证

3．2 IVIg制品抑制炎症因子表达结果

3．3 唾液酸化的Fc片段抑制炎症因子表达结果

4 讨论

结论及后续工作建议

参考文献

附录Ⅰ 英汉缩略词对照

附录Ⅱ 硕士期间发表论文

附录Ⅲ 硕士期间参与项目及会议培训

文献综述

致谢

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