人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究

摘要

疟疾是经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的传染病，严重危害人类健康。能感染人的疟原虫有5种，其中恶性疟原虫的毒力最强，致死率最高。
　　红内期恶性疟原虫寄生于人成熟红细胞中，这导致它们之间存在错综复杂的相互作用关系。microRNAs是种广泛存在于真核生物中的长度～22nt的单链非编码RNA,其在细胞质中与Dicer、Argonaute(AGO)等蛋白形成复合物而诱导基因沉默，主要通过碱基互补配对与靶基因mRNA的UTR或者CDS结合，使靶mRNA脱腺苷化、降解和抑制翻译。最近，LaMonte等人的研究显示宿主miRNA-451和let-7i移位到红内期恶性疟原虫虫体中，与恶性疟原虫PKA-R转录本发生嵌合来抑制调节性PKA亚基的翻译，进而抑制虫体的生长;同样，在鼠中，发现鼠的miR-155能够增强小鼠对疟原虫的免疫力;在冈比亚按蚊中，冈比亚按蚊的aga-miR-305能够提高冈比亚按蚊对疟疾虫的免疫力。这些研究结果都表明宿主microRNAs能对疟原虫基因进行调控来对抗疟疾。
　　人miR-185是本实验室在恶性疟原虫3D7里发现的宿主miRNA之一，且含量很高，通过预测得知其和var(pfl1955w)的dbl序列靶向互补，提示人miR-185可能调控恶性疟原虫var基因和功能。有相关文献报道称，人miR-185在对肿瘤和代谢性疾病的调控起重要作用，如miR-185负向调控雄激素受体抑制前列腺癌细胞;miR-185靶向原癌基因Six1抑制肿瘤的生长，靶向SOCS3基因抑制糖尿病功能紊乱等等。
　　为了探讨人miR-185对恶性疟原虫var(pfl1955w)基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响，我们体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7，构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒，再分别用Lipofectamine2000转染293T细胞和Cytomix电转到恶性疟原虫3D7，流式细胞仪检测转染效率，用双荧光素酶报告验证人miR-185对var(pfl1955w)的dbl区域直接调控作用，Q-PCR检测var(pfl1955w)mRNA的表达，细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附。
　　结果显示，转染293T细胞和恶性疟原虫3D7的效率在50％以上;过表达人miR-185可显著抑制含var(pfl1955w) dbl的荧光素酶基因的表达(p＜0.001);在293T细胞和恶性疟原虫3D7中，过表达人miR-185能够减少var(pfl1955w)mRNA的含量(p＜0.05)，并使感染红细胞粘附作用下降了39％。综上表明，人miR-185对疟原虫var(pfl1955w)基因表达有下调作用，进而影响恶性疟原虫的粘附。

目录

摘要

一．前言

1．疟疾及疟原虫简介

2．RNA干扰jI麟盎

3．疟原虫中RNAi研究概述

4．MicroRNAs介绍及在疟疾基因调控作用

5．var基因和PFEMP1蛋白

二、实验材料

1．主要生物化学试剂及耗材

2．引物、MicroRNA mimics／inhibitor

3．质粒载体

4．疟原虫虫株

5．主要仪器设备

6．分析软件

三、实验方法

1．红内期恶性疟原虫3D7的体外培养、冻存与复苏

1．1 恶性疟原虫3D7的体外培养

1．2 恶性疟原虫3D7的冻存

1．3 恶性疟原虫3D7的复苏

2．红内期恶性疟原虫3D7的同步化、富集与虫体提取

2．1 红内期恶性疟原虫3D7的同步化

2．2 裂殖体期恶性疟原虫3D7的富集

2．3 恶性疟原虫3D7虫体的提取

3．恶性疟原虫3D7虫体可溶蛋白的提取

3．1 细胞裂解液的配制

3．2 可溶蛋白提取步骤

3．3 SDS-聚丙烯毗肢凝胶电泳

3．4 蛋白免疫印迹

4．总RNA提取与检测

4．1 总RNA的提取

4．2 RNA样品的DNase消化

4．3 RNA的凝胶电泳

5．hsa-miRNAs靶基因预测

6．质粒的构建

7．293T细胞培养

7．1 高糖DMEM完全培养基的配制

7．2 细胞复苏

7．3 细胞的镜下观察

7．4 细胞计数

7．5 贴壁细胞的传代培养

7．6 细胞冻存

7．7 HUVEC细胞培养

8．hsa-miRNA靶基因的体外筛选

8．1 293T细胞的转染(Transfection)

8．2 双荧光素酶实验(Dual-LuciferaseReporterAssay)

9．融合表达质粒构建

10．粘附实验

11．统计学分析

四、实验结果

本研究基本思路

4．1 靶点预测发现人miR-185靶向疟原虫var(pfl1955w)基因的db1序列

4．2 双荧光紊酶实验验证人miR-185靶向db1

4．3 293T细胞中，人miR-185能够下调var(pf11955w)mRNA表达

4．4 在恶性疟原虫内，人miR-185能够下调var(p111955w)mRNA表达

4．5 人miR-185减弱感染的红细胞与人内皮细胞间粘附

五：讨论

六．小结

参考文献

附录

硕士研究生期间发表的文章和参加的会议

致谢

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