脂联素基因启动子变异的功能研究

摘要

目的:脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞特异性分泌的一种蛋白。研究表明血清脂联素水平与代谢综合征和肿瘤相关，而脂联素基因启动子变异影响其功能的发挥。我们前期探讨了脂联素基因启动子区SNP多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)发生发展的相关性，发现SNP-12140G等位基因有可能是NSCLC的危险因素(OR=1.516;95％ CI:1.098-2.094)。为更深一步地阐明脂联素基因结构变异和mRNA的关系，在本研究中，我们将对脂联素基因启动子变异的功能进行初步探讨。
　　方法:1.利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增APM1基因启动子区;2.将APM1基因启动子区连接至萤火虫萤光素酶报告基因载体pGL4.11上，构建萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒;3.利用多位点基因定点突变试剂盒对重组质粒进行基因突变，获得包含3个SNP(SNP-12140G＞A，SNP-11426A＞G，SNP-11377C＞G)不同组合的8个单倍体的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。4.测序分析重组质粒是否突变成功;5.重组质粒与海肾荧光素酶报告基因pGL4.74共转染诱导分化第八天的小鼠前脂肪细胞3T3 L1;6.转染后48h检测萤火虫萤光素酶的活性以反映所连接的启动子变异的作用。
　　结果:成功构建重组质粒，并完成基因定点突变;获得8中不同SNP组合的单倍体重组质粒;瞬时转染小鼠前脂肪细胞3T3L1，不同单倍型的重组质粒表达的荧光素酶报告基因活性具有差异;在8种重组质粒中，具有SNP-11377C＞G的C等位基因的单倍型重组质粒的萤火虫荧光素酶报告基因活性的表达量高于G等位基因的重组质粒;在SNP-11377C＞G等位基因为G的4种重组质粒中，SNP-12140G＞A的A等位基因的重组质粒所表达的萤火虫荧光素酶报告基因活性高于G等位基因的重组质粒;SNP-11426基因型与荧光素酶活性表达没有明显的关系。
　　结论:脂联素基因启动子变异能够通过影响启动子的活性来影响脂联素基因的表达;脂联素基因启动子区SNP-11377C＞G和SNP-12140G＞A可改变脂联素启动子的功能;SNP-11426与脂联素启动子的功能无明显相关性。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 样品处理

2．1．3 细胞株及质粒

2．1．4 实验试剂用品

2．1．5 主要仪器设备

2．1．6 序列合成及测定

2．2 实验方法

2．2．1 基因组DNA提取

2．2．2 DNA定量

2．2．3 PCR引物设计

2．2．4 PCR扩增

2．2．5 重组质粒构建

2．2．6 APM1基因启动子定点突变

2．2．7 转染3T3L1细胞

2．2．8 双荧光素酶报告基因检测

2．2．9 数据统计

第三章 实验结果

3．1 临床样本特征

3．2 DNA提取

3．3 APM1启动子区PCR产物琼脂糖凝胶电泳

3．4 APM1启动子区PCR产物测序

3．5 测序结果统计

3．6 重组子构建

3．6．1 pGL4．11酶切

3．6．2 APM1片段酶切

3．6．3 pGL4．11-APM1重组子酶切鉴定

3．7 APM1定点突变鉴定

3．8 小鼠前脂肪细胞3T3L诱导成熟

3．9 不同单体型APM1启动子区萤光素酶报告基因活性检测

3．9．1 不同单体型APM1启动子区萤光素酶报告基因活性

3．9．2 萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值

3．10 数据统计

第四章 讨论

第五章 小结与展望

5．1 小结

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

作者简历

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