oHSV1-hTERT-GFP法检测循环肿瘤细胞在小细胞肺癌和NK/T细胞淋巴瘤中的应用

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 oHSV1-hTERT-GFP法检测小细胞肺癌循环肿瘤细胞
　　小细胞肺癌属于神经内分泌肿瘤，在细胞学上呈现出多种形态，表面标记物易变，无法通过基于肿瘤细胞物理学性质的方法和基于细胞表面标记物的方法对小细胞肺癌细胞进行示踪。在正常人体组织细胞中活性被抑制的端粒酶，在肿瘤细胞中处于活化状态，可以特异性示踪循环肿瘤细胞。本研究拟建立基于插入人端粒酶启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的单纯疱疹病毒（oHSV1-hTERT-GFP）检测小细胞肺癌外周血中循环肿瘤细胞的方法。
　　在本研究中，我们通过用病毒oHSV1-hTERT-GFP感染不同肺癌细胞系，结果显示这些肺癌细胞感染病毒后均有绿色荧光蛋白的稳定表达，且转染病毒后24小时的表达量显著多于16小时。通过激光聚焦共定位实验，我们发现转染oHSV1-hTERT-GFP病毒后稳定表达绿色荧光蛋白的细胞同时也表达CD56，由此证实了oHSV1-hTERT-GFP病毒示踪小细胞肺癌细胞的特异性高。建立循环肿瘤细胞模型，然后用oHSV1-hTERT-GF法检测模型中的CD45-/GFP+细胞，并用软件Excel分析此法对小细胞肺癌细胞的捕获效率和可重复性。实验结果显示:在NCI-H69细胞模型中，CD45-/GFP+细胞的总体检出率为87.7％;NCI-H446细胞的组别中，总体检出率为89.8％。由此说明HSV1-hTERT-GFP法检测小细胞肺癌外周血中循环肿瘤细胞的效率高、可重复性好。
　　最后，我们收集了100例健康体检者外周血样本作为阴性对照，通过此法检测CD45-/GFP+细胞，检测出的细胞数为0.91±0.53（个）/4mL，真阴性率为98％（检出细胞数≤3个/4ml）。同时，我们收集了40例原发性小细胞肺癌患者外周血样本，其中有28例为广泛期小细胞肺癌，12例为局限期小细胞肺癌，这40例病人均接受了化疗和胸部放疗，其中有23例做了脑预防治疗。检测结果发现小细胞肺癌病人治疗前外周血中CD45-/GFP+细胞平均计数显著高于健康人，其中广泛期CD45-/GFP+细胞平均数显著高于局限期。这40例小细胞肺癌初治病人CD45-/GFP+的检出率为92.5％，其中广泛期检出率为100％，局限期为75％。配对对比分析显示:病情缓解的病例中，治疗前患者外周血中CD45-/GFP+细胞数显著多于放化疗后。一例病情进展的病人检测结果由治疗前的6个上升为17个。由此可见，检测到的CD45-/GFP+细胞数变化与临床上的病情变化相符。
　　综上，本研究建立了oHSV1-hTERT-GFP法检测小细胞肺癌外周血中的循环肿瘤细胞，经过验证，此方法具有潜在的临床应用价值。
　　第二部分 oHSV1-hTERT-GFP法检测CTCs在NK/T细胞淋巴瘤中的应用
　　在本论文的第一部分，我们已经建立了oHSV1-hTERT-GFP法检测小细胞肺癌循环肿瘤细胞的技术平台并且对该技术进行了相关的验证和探讨。最后，我们得出这样的结论:oHSV1-hTERT-GFP法不依赖肿瘤细胞的表面标记物，不受肿瘤细胞形态、大小易变的限制，检测瘤谱广。
　　因此，本研究拟建立基于oHSV1-hTERT-GFP的技术检测NK/T细胞淋巴瘤外周血中循环肿瘤细胞的平台，并且对其可靠性进行了验证。首先，我们通过荧光显微镜来观察不同的淋巴瘤细胞系在感染病毒oHSV1-hTERT-GFP后不同时间的荧光强度，从而判断绿色荧光蛋白的表达情况。结果发现感染病毒oHSV1-hTERT-GFP的不同淋巴瘤细胞均可以稳定表达绿色荧光蛋白，且感染后24小时表达的绿色荧光蛋白表达量较感染后16小时显著增加。本研究中我们所用的NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK6为CD56标记物阳性，因此在验证实验中，通过CD56与绿色荧光蛋白进行共定位来验证oHSV1-hTERT-GFP对NK/T细胞淋巴瘤循环肿瘤细胞示踪的特异性。通过激光共聚焦实验，我们发现CD56与绿色荧光蛋白共定位于同一个细胞，从而证明了oHSV1-hTERT-GFP对NK/T细胞淋巴瘤示踪可靠性。
　　最后，我们将此检测方法应用到了临床实验中，收集了50例健康正常人外周血样本作为阴性对照，从内科收集了20例NK/T细胞淋巴瘤患者治疗前与治疗后的外周血样本，用oHSV1-hTERT-GFP法检测样本中的循环肿瘤细胞，检测结果发现50例健康对照的GFP+细胞检测出数为28.78±14.05（个）/105，真阴性率为98％（检出细胞数＜50个/4ml）。NK/T细胞淋巴瘤病人治疗前外周血中GFP+细胞平均计数为435.25±488.76(个)/105显著高于对照的28.78±14.05（个）/105。其中NK/T细胞淋巴瘤病人Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期GFP+细胞平均计数分别为52±27.24（个）/105，142.57±53.82（个）/105，609.29±212.07（个）/105，1617±239（个）/105。由此可见，随着NK/T细胞淋巴瘤临床分期的上升，检测的GFP+细胞数明显增加。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的GFP+细胞阳性率分别为75％，85.7％，100％，100％。经过临床治疗后病情缓解的这20个病例中，GFP+细胞计数为113.95±110.93（个）/105显著少于治疗前的435.25±488.76（个）/105。由此可见，此法检测NK/T细胞淋巴瘤循环肿瘤细胞的数目变化与临床病情相符。因此，oHSV1-hTERT-GFP法检测循环肿瘤细胞在NK/T细胞淋巴瘤的诊断、评价预后、早期发现肿瘤的转移、复发具有一定潜在的临床应用价值。

目录

图表索引

英文缩略词

材料与方法

第一章 实验材料与主要试剂

一、细胞系

二、病毒

三、临床标本

四、抗体

五、主要试剂

六、主要仪器和耗材

第二章 实验方法

一、细胞培养

二、不同肿瘤细胞系感染oHSV1-hTERT-GFP后GFP表达情况的实验

三、激光共聚焦定位实验

四、oHSV1-hTERT-GFP方法检测小细胞肺癌肿瘤细胞回收率实验

五、oHSV1．hTERT-GFP方法检测外周血中的循环肿瘤细胞

六、统计学分析结果

第一部分 oHSV1-hTERT-GFP法检测小细胞肺癌循环肿瘤细胞

摘要

第一章 导论

第二章 实验结果

一、经过验证，oHSV1．hTERT-GFP病毒可以示踪SCLC细胞

二、oHSV1．hTERT-GFP方法检测循环肿瘤细胞在小细胞肺癌中的应用

第三章 讨论

第四章 小结

第二部分 oHSV1-hTERT-GFP法检测CTCs在NK／T细胞淋巴瘤中的应用

摘要

第一章 导论

第二章 实验结果

一、经过验证，oHSV1-hTERT-GFP病毒可以示踪NK／TCL细胞

二、oHSV1-hTERT-GFP方法检测循环肿瘤细胞在NK／T细胞淋巴瘤中的应用

第三章 讨论

第四章 小结

参考文献

文献综述 循环肿瘤细胞检测在小细胞肺癌中的应用

致谢

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