红斑狼疮动脉粥样硬化小鼠模型建立、发病机制及痉氯喹干预研究

摘要

目的：
　　1.建立稳定的系统性红斑狼疮动脉粥样硬化动物模型。
　　2.利用小鼠模型，观察系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)对动脉粥样硬化严重程度的影响。
　　3.进一步观察狼疮动脉粥样硬化病变特点，尤其是免疫系统在动脉局部以及全身的改变，以及血脂变化特点，初步探讨狼疮动脉粥样硬化发病的潜在机制。
　　4.研究常用的抗SLE药物——羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)对动脉粥样硬化的影响，并初步观察其对血脂以及炎症反应的影响，为临床上治疗动脉粥样硬化提供新的选择。
　　方法：
　　1.应用apoE-/-以及C57BL/6小鼠，8周龄时通过腹腔内一次性注射0.5mlpristane构建SLE模型。部分小鼠通过饮水给予HCQ。
　　2.通过检测自身抗体水平检验狼疮模型构造是否成功，通过观察动脉粥样硬化斑块是否形成明确动脉粥样硬化模型构建是否成功。
　　3.6个月后检测尿蛋白，处死小鼠。分离血清，检测血脂、白蛋白、总IgG、干扰素α(interferon-α，IFN-α)。
　　4.分离小鼠主动脉、心脏，进行主动脉大体油红O染色，主动脉流式细胞术检测CD45+、CD19+、CD68+、CD11c+细胞，主动脉瓣根部组织连续冰冻切片，进行油红O染色、IgG免疫荧光染色、CD19+、CD68+、CD11c+细胞免疫荧光染色。
　　5.制备脾细胞悬液，流式细胞术检测CD3+、CD19+、CD11b+、CD11c+细胞比例。
　　结果：
　　1.模型构建成功:注射了pristane的小鼠dsDNA抗体阳性。服用HCQ导致注射了pristane的小鼠dsDNA抗体阳性率降低。
　　2.小鼠外观变化:部分狼疮小鼠出现脱毛、皮肤出血，非狼疮小鼠无上述现象。
　　3.apoE-/-小鼠体重更重。
　　4.生化指标:
　　apoE-/-小鼠LDL-C、TC高于C57BL/6小鼠。
　　高脂饲料喂养的小鼠LDL-C、TC高于普通饮食小鼠。
　　狼疮发病对LDL-C无影响，狼疮小鼠TC低于非狼疮小鼠。
　　HCQ对LDL-C、TC水平无显著性影响，轻度降低血脂。
　　狼疮小鼠Alb低于非狼疮小鼠，羟氯喹对Alb水平无影响。
　　5.动脉粥样硬化斑块进展情况:
　　狼疮小鼠主动脉斑块面积大于非狼疮小鼠，高脂饲料喂养小鼠斑块面积多于普通饮食小鼠。至处死时，只有apoE-/-小鼠主动脉出现了斑块，所有C57BL/6小鼠都没有观察到主动脉斑块。
　　狼疮小鼠主动脉瓣根部斑块面积大于非狼疮小鼠，高腊饲料喂养的小鼠主动脉瓣根部斑块面积多于普通饮食小鼠。只有apoE-/-小鼠主动脉瓣根部有斑块，所有C57BL/6小鼠都没有观察到主动脉瓣根部斑块。狼疮对主动脉瓣根部斑块的促进作用在高脂饲料喂养的apoE-/-小鼠中更明显。
　　羟氯喹具有抑制主动脉斑块以及主动脉瓣根部斑块形成的作用。
　　6.斑块成分特点:
　　狼疮发病导致主动脉细胞增加，apoE-/-小鼠主动脉细胞数目多于C57BL/6小鼠。使用羟氯喹减少主动脉细胞数目。
　　狼疮小鼠主动脉白细胞总数、树突状细胞、巨噬细胞数量增加，B细胞减少。
　　羟氯喹降低狼疮小鼠主动脉白细胞、树突状细胞、巨噬细胞数目，增加狼疮小鼠B细胞数目，对非狼疮小鼠主动脉细胞数目无影响。
　　狼疮小鼠CD68+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞定位基本一致。
　　大量IgG沉积在主动脉瓣根部，B细胞也聚集在IgG沉积部位。狼疮小鼠斑块中IgG沉积增多，且更加质密，高脂饲料喂养导致IgG沉积增多。羟氯喹显著减少apoE-/-小鼠主动脉斑块IgG沉积。
　　狼疮小鼠血清IgG高于非狼疮小鼠，高脂饲料喂养的小鼠血清IgG低于普通饮食小鼠，apoE-/-小鼠IgG低于C57BL/6小鼠。HCQ对血清IgG水平无影响。主动脉斑块IgG沉积与血清IgG含量呈低度负相关。
　　7.狼疮发病、小鼠动脉硬化易感的基因型导致脾脏指数增加，高脂饲料、羟氯喹对脾脏指数无影响。
　　狼疮小鼠脾脏淋巴细胞减少，高脂饲料也导致脾脏淋巴细胞减少。羟氯喹对小鼠脾脏B细胞比例无影响。羟氯喹增加狼疮小鼠脾脏T细胞比例，对非狼疮小鼠脾脏T细胞比例无影响。
　　狼疮小鼠脾脏CD11 c+细胞增多，高脂饲料导致脾脏CD11 c+细胞减少。羟氯喹对小鼠脾脏CD11c+细胞比例无显著影响。
　　狼疮小鼠脾脏CD11b+细胞无显著变化，羟氯喹对脾脏CD11b+细胞比例无影响。
　　8.狼疮小鼠尿蛋白高于非狼疮小鼠。HCQ不影响apoE-/-小鼠尿蛋白水平，但是降低C57BL/6小鼠尿蛋白水平。
　　9.个别狼疮小鼠血清IFN-α升高，无统计学显著性。
　　结论：
　　1.apoE-/-、C57BL/6小鼠通过腹腔注射pristane可以成功诱导狼疮疾病模型，
　　2.apoE-/-小鼠容易出现主动脉粥样硬化斑块，C57BL/6小鼠不出现明显斑块。
　　3.狼疮小鼠动脉粥样硬化加重。
　　4.狼疮小鼠的心血管传统危险因素（总胆固醇）降低，但是狼疮小鼠主动脉内炎性反应异常活跃（树突状细胞、巨噬细胞增多，B细胞减少，IgG沉积增多）;同时出现全身免疫状态异常（脾脏淋巴细胞减少，树突状细胞增多，血清白蛋白降低，IgG升高）。
　　5.羟氯喹可以降低dsDNA抗体，可以减轻动脉粥样硬化。
　　6.羟氯喹对血脂无显著性影响，可以部分逆转狼疮所致的动脉粥样硬化的斑块成分异常以及脾脏细胞比例异常。
　　7.高脂饲料也可以通过升高血脂以及加重免疫系统异常从而加重动脉粥样硬化。
　　8.狼疮小鼠血清IFN-α无显著变化。

目录

摘要

一．实验背景

二．实验用具

1．实验试剂及材料

2．仪器、设备

三．实验方法

1．小鼠模型建立及分组

2．标本获取

3．冰冻切片制作

4．主动脉油红O染色

5．切片油红O染色

6．主动脉瓣根部CD11c(DC细胞)+CD68染色(巨噬细胞)免疫荧光染色

7．主动脉瓣根部CD19+免疫球蛋白IgG免疫荧光染色

8．图像分析

9．主动脉细胞流式细胞仪检测

10．脾细胞流式检测

11．血生化指标分析

12．血清IFN-α检测(ELISA试剂盒)

13．血清anti-dsDNA抗体检测

14．尿蛋白检测

15．统计学处理

四．实验结果

1．Pristane腹腔注射诱发狼疮及腹腔炎症

2．小鼠体重变化与APOE缺失相关，但与狼疮发病无关

3．Pristane诱导的狼疮导致总胆固醇降低

4．狼疮以及高脂饲料导致动脉粥样硬化易感小鼠主动脉油红O染色面积比例增加

5．狼疮以及高脂饲料导致动脉粥样硬化易感小鼠主动脉瓣根部油红O染色面积增加

6．狼疮和高脂饲料均可促进炎症细胞及IgG在主动脉斑块的集聚

7．狼疮小鼠血清总IgG升高

8．狼疮小鼠脾脏指数升高

9．狼疮小鼠脾脏淋巴细胞减少，树突状细胞增多

10．狼疮小鼠蛋白尿升高

11．狼疮小鼠血清白蛋白水平降低

12．小鼠血清IFN-α变化不显著

五．讨论

1．首次以ApoE-／-小鼠为基础构建了狼疮动脉粥样硬化模型

2．狼疮引起的炎症反应加重动脉粥样硬化的形成

3．狼疮小鼠全身免疫状态异常也参与动脉粥样硬化进展

4．羟氯喹(HCQ)显著减少斑块，逆转狼疮所致的免疫异常状态

5．高脂饲料加重小鼠动脉粥样硬化，改变小鼠免疫系统状态

6．狼疮小鼠血清IFN-α无显著变化

7．总结与展望

六．实验结论

参考文献

文献综述 干扰素α与狼疮动脉粥样硬化

致谢

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