IMPX977对MeCP2蛋白表达的影响以及基于IP-MS技术对不同物种大脑中MeCP2的功能研究

摘要

Rett综合征(Rett syndrome，RTT)是一种X连锁的神经发育障碍性遗传病，在女性严重智力低下的致病因素中占主导地位。编码甲基化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2，MeCP2)的基因发生突变是导致RTT病理学改变的主要原因，MeCP2作为转录抑制因子调控基因表达。在RTT发病机制中，由于缺乏MeCP2蛋白与甲基化DNA的结合，阻碍了其对下游靶基因的调控，最终导致脑功能障碍。目前，对于MeCP2在脑发育过程中的重要作用以及如何导致RTT的发生发展，其机制尚未明确。而且目前还没有针对RTT的获批准的治疗药物上市，减轻RTT的症状将成为一个重要的治疗手段。因此本实验从RTT致病的根本原因考虑，以增加MeCP2表达水平为研究方向，从分子和基因两方面来探究IMPX977对大鼠MeCP2表达的影响，同时应用免疫共沉淀联用质谱技术研究MeCP2相互作用蛋白分子，试图探索MeCP2蛋白在体内的生物学功能。实验共分为四个部分:
　　第一章 正常雄性大鼠各组织中MeCP2的表达
　　目的：为了研究RTT的发病机制中MeCP2基因产物的功能和定位，进行了MeCP2蛋白大鼠体内区域分布的研究，对多种组织的裂解液进行免疫印迹分析和实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定，以期从分子和基因水平层面研究MeCP2在野生型雄性大鼠体内的组织分布。
　　方法：将6周龄野生型雄性大鼠置于动物房饲养三天，取出用水合氯醛麻醉后断头处死，在冰浴上迅速分离海马、皮层、小脑组织，并分离心、肝、脾、肺、肾和肌肉组织，通过Western blotting技术，研究MeCP2蛋白在大鼠体内的组织分布;同时，提取多种组织的总RNA，检测完整性，逆转录成cDNA后，进行RT-PCR检测，在分子层面研究MeCP2mRNA的表达水平。
　　结果：Western blotting实验结果显示MeCP2蛋白主要在脑组织中高表达，包括小脑、皮层和海马组织，其次为脾、肺和心脏组织，在肝脏、肾脏和肌肉中含量较少。RT-PCR实验结果显示海马、皮层和小脑组织中MeCP2mRNA高表达。
　　结论：MeCP2蛋白在大鼠的神经发育中起着重要的作用，MeCP2蛋白和mRNA水平没有明显的关联，可能原因是存在转录后调控的组织特异性。
　　第二章 IMPX977对雄性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响
　　目的：研究不同剂量的IMPX977对雄性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响。
　　方法：将雄性SD大鼠分为4组，空白对照组、橄榄油组（阴性对照组）、IMPX977低剂量组(10mg/kg)和IMPX977高剂量组(30mg/kg)。连续灌胃给药两周，末次给药结束后水合氯醛麻醉断头取脑，分离皮层、小脑、心、脾和肺组织。通过Western blotting技术，研究不同剂量IMPX977对多种组织中MeCP2蛋白表达的影响。同时，提取小脑和皮层组织中的总RNA，检测完整性，逆转录成cDNA后，进行RT-PCR检测，在分子层面研究IMPX977对MeCP2mRNA表达水平的影响。
　　结果：Western blotting实验结果显示，与空白对照组相比，橄榄油组大鼠小脑和心脏组织中MeCP2蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05，P＜0.05)，而IMPX977高剂量组大鼠心脏和脾脏组织中MeCP2蛋白的表达量都显著性降低(P＜0.01，P＜0.05)。同时，IMPX977低剂量组皮层组织中MeCP2蛋白表达显著上调。RT-PCR实验结果显示，相较于空白对照组或者阴性对照组，IMPX977低剂量组大鼠小脑组织中MeCP2蛋白的表达量明显升高。而与空白对照组相比，IMPX977低剂量组和高剂量组大鼠皮层组织中MeCP2基因的表达量均显著性降低。
　　结论：低剂量IMPX977(10mg/kg)对雄性大鼠皮层组织中MeCP2蛋白的表达有显著上调的作用，但是与基因表达水平趋势并不一致。
　　第三章 IMPX977对雌性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响
　　目的：研究不同剂量的IMPX977对雌性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响。
　　方法：将雌性SD大鼠分为4组，空白对照组、橄榄油组（阴性对照组）、IMPX977低剂量组(10mg/kg)和IMPX977高剂量组(30mg/kg)。连续灌胃给药两周，末次给药结束后断头处死，冰浴上迅速分离皮层和小脑组织。通过Western blotting技术，研究不同剂量IMPX977对两种组织中MeCP2蛋白表达量的影响。同时，提取小脑和皮层组织中的总RNA，逆转录成cDNA后，进行RT-PCR分析，在分子层面研究不同剂量IMPX977对MeCP2mRNA表达水平的影响。
　　结果：Western blotting实验结果显示，与空白对照组相比，橄榄油组、IMPX977低剂量组和高剂量组大鼠小脑组织中MeCP2蛋白表达水平均有升高，但都没有显著性差异(P＞0.05，P＞0.05)。RT-PCR实验结果显示，相较于空白对照组，其他三组大鼠小脑组织中MeCP2基因表达水平没有明显变化。而阴性对照组和IMPX977高剂量组大鼠皮层组织中MeCP2基因表达量均显著降低。
　　结论：两种剂量的IMPX977对雌性大鼠小脑、皮层组织中MeCP2蛋白的表达没有明显变化。
　　第四章 免疫共沉淀联合质谱筛选MeCP2相互作用蛋白质及蛋白质相互作用数据评价
　　目的：研究皮层组织中MeCP2相互作用蛋白质，试图探索MeCP2在皮层组织中如何发挥生理功能。
　　方法：将雄性SD大鼠、C57BL/6小鼠和雌性食蟹猴饲养一周后，用水合氯醛(0.3-0.4mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠和小鼠，用盐酸氯胺酮(3mg/kg)肌肉注射麻醉食蟹猴，在冰浴上迅速分离皮层组织。通过IP-MS(免疫共沉淀联用质谱)技术、Western blotting技术、SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、切取SDS-PAGE胶上蛋白质LTQ质谱鉴定其组成成分，探究在不同生物皮层组织中MeCP2相互作用的蛋白质，采用生物信息学方法对所获得的候选蛋白质进行评估分析。
　　结果：考马斯亮蓝染色结果显示，MeCP2蛋白呈现清晰的条带，且在大鼠、小鼠、食蟹猴样品中的颜色深浅不一，MeCP2蛋白总量高低不同。Western blotting结果显示，在小鼠input样品中，MeCP2蛋白得到了富集，且在大鼠、小鼠和食蟹猴IP样品中MeCP2的含量不一，相对分子质量也不相同。应用生物信息学对小鼠IP-MS结果进行分析，发现MeCP2相互作用蛋白候选分子肽段数最高的是KIF5B和KCL1，靶蛋白主要与信号转导通路、细胞应激反应、转录调控等过程有关，其中与EGFR信号转导通路、FGF信号转导通路、Wnt信号转导通路、Cadherin信号转导通路关系密切，并参与了帕金森病、亨廷顿舞蹈症等疾病的发病过程。
　　结论：这些相互作用蛋白质的获得为全面揭示MeCP2的生物学功能、深入研究MeCP2转录调控机制以及其参与RTT发病过程均提供了线索和研究思路，为下一步的深入研究提供了科学依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(Abbreviation)

前言

参考文献

第一章 正常雄性大鼠各组织中MeCP2的表达水平

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二章 IMPX977对雄性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三章 IMPX977对雌性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第四章 免疫共沉淀联合质谱筛选MeCP2相互作用蛋白质及蛋白质相互作用数据评价

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

结语与展望

个人简历

致谢