IL3-LDM靶向融合蛋白对人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治疗作用研究；CD26慢病毒表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

摘要

本文主要从以下几部分进行讨论：
　　第一部分 IL3-LDM靶向融合蛋白对人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治疗作用研究
　　目的:利用分离的人外周血单个核细胞建立急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型，观察小鼠的一般情况、应用流式细胞术检测外周血CD45细胞阳性率，病理学检查鉴定动物模型;利用该模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病小鼠的治疗作用。
　　方法:1.人外周血单个核细胞的分离和培养，流式细胞仪检测其免疫表型，进行AML干细胞特性的鉴定;
　　2.人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的建立:将NOD/SCID小鼠随机分为模型组和对照组，两组小鼠经全身X线照射300cGay，6-12个小时内通过尾静脉注射AML病人样本中CD123阳性率最高的人外周血单个核细胞(用台盼蓝拒染法，细胞活性95％，1×107个/只，液体总量0.2 ml)到模型组小鼠，对照组小鼠通过尾静脉注射等体积PBS作为正常对照;
　　3.急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的鉴定:观察小鼠的一般情况;流式细胞术检测小鼠外周血CD45细胞阳性率;移植60天后处死小鼠，采用组织病理检查，检测小鼠肝脏、脾脏、肺脏等的白血病特征。
　　4.利用上述建立的模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病小鼠的治疗作用，设置多个治疗组，并进行疗效评价。
　　结果:1.分离并培养人外周血单个核细胞，经抗人CD34-PE、CD38-FITC、CD123-PerCPcy5.5抗体标记后，流式细胞术检测结果显示有CD34+CD38-细胞群，而且CD123+细胞占AML干细胞的比例均为90％以上。
　　2.成功建立人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型:移植后的模型组小鼠均发生典型白血病表现，而对照组小鼠无;模型组小鼠的尾血中检测CD45+细胞，而对照组小鼠无;模型组NOD/SCID小鼠的肝、脾、肺等均有肿瘤细胞浸润，细胞呈团块状生长，包绕器官或者浸润器官内部，受浸润组织结构破坏，而对照组小鼠的相应组织未发现明显肿瘤细胞浸润。
　　3.体内实验证明，经IL3-LDM靶向融合蛋白治疗后，白血病模型小鼠组一般情况明显好于模型组（PBS对照组），其外周血的白血病细胞含量明显下降，其肺、肾、脾等脏器的炎症及病理变化减轻。
　　结论:采用NOD/SCID小鼠在给予全身照射的移植前预处理基础上成功建立了人急性髓系白血病的动物模型，为研究AML的可能发病机制奠定了基础。体内实验进一步证实，IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病细胞有一定的杀伤抑制作用，IL3-LDM融合蛋白也为临床治疗AML提供了新思路。
　　第二部分 CD26慢病毒表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立
　　CD26作为一种具有多种生物学功能的蛋白酶类，在炎性反应、组织修复、细胞移行、肿瘤侵袭、免疫调节、信号转导及细胞、凋亡等生理及病理过程中均起到重要作用。在临床中与多种肿瘤疾病存在相关性，可以作为肿瘤的预测因子或生物标志物。针对CD26的深入研究，对于揭示相关肿瘤疾病的发病机制，促进临床诊断、鉴别分析，分子靶向治疗的开展和判定疗效及预后等，均不失有潜在的重要意义，CD26也有望成为未来疾病治疗的新靶点。
　　目的:构建人CD26慢病毒表达载体，转染NIH/3T3细胞，建立稳定转染的NIH/3T3细胞株。
　　方法:抽提含pCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒载体的质粒和pEZ-Lv105-CD26质粒。利用XBaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，用T4连接酶将胶回收的CD26目的片段克隆至载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP，构建形成pCDH-CD26质粒。转化DH5à感受态细胞，菌落PCR初步筛选出阳性克隆，并进行酶切鉴定和送测序分析。利用三质粒慢病毒系统转染293T细胞，生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染NIH/3T3细胞，通过FACS AriaⅢ(BD公司)流式细胞仪分选出表达CD26的阳性细胞，并进一步用FACS做分析鉴定，获得稳定转染NIH/3T3细胞株。
　　结果:成功构建pCDH-CD26慢病毒表达载体，并包装出慢病毒，检测病毒浓缩液的滴度为3×108TU/mL。利用此病毒浓缩液成功感染NIH/3T3细胞，经过流式细胞仪的分析和分选，表达CD26的NIH/3T3细胞阳性率达到70％以上，筛选到稳定表达人CD26的NIH/3T3细胞株。
　　结论:人CD26慢病毒表达载体成功构建和稳定转染NIH/3T3细胞株的建立，为进一步研究CD26的功能奠定了良好的实验基础。

目录

第一部分 IL3-LDM靶向融合蛋白对人急性髓系白血病NOD／SCID小鼠模型的治疗作用研究

摘要

前言

材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 CD26慢病毒表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

摘要

前言

材料和方法

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 单克隆抗体在治疗癌症方面的研究进展

致谢

附录

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