粗壮女贞降脂作用研究及机制探讨

摘要

随着经济的迅猛发展和人们生活方式的改变，心脑血管疾病已成为人们身体健康的头号杀手。降低血脂、改善血脂异常在临床治疗中能降低心脑血管病发生率和死亡率。因此，目前十分需要积极地研究和探索新型的降血脂药物，尤其是从天然产物中寻找和发现有价值的物质。
　　粗壮女贞是我国西南地区苦丁茶的主要基源植物之一，在我国拥有悠久的饮用历史，以茶剂的形式广泛用于高血压、高血脂和肥胖人群。但它的作用机制不甚清楚。因此对粗壮女贞降脂效果进行系统的药效学评价和机制研究显得尤为重要。粗壮女贞总苷是从粗壮女贞老叶中提取制备的水溶性苯乙醇苷类成分，本文首先通过动物模型评价粗壮女贞总苷(CNTG)的降脂效果并进行初步的降脂机制研究。将Syrian金黄地鼠随机分为正常组、高脂模型组、阳性药非诺贝特组及CNTG高、中、低剂量组。连续给药4周，在给药2周、3周及4周后分别取血检测血清中脂质的含量。实验结束时剖取肝脏进行肝脏脂质含量测定和肝脏病理检测。并应用实时定量PCR检测粗壮女贞总苷对肝脏中相关基因mRNA表达水平的影响;用Western blot法检测相关蛋白表达水平。实验结果表明，给药2周、3周、4周后，与模型组相比，CNTG高剂量组血清和肝脏中的TC、TG、LDL-C含量均显著降低;并可明显减轻肝细胞病变。CNTG高剂量组明显升高AMPK mRNA的相对表达量和LKB1、phospho-LKB1及phospho-AMPK的蛋白表达水平，表明CNTG能促进地鼠肝脏中LKB1磷酸化从而激活AMPK发挥降脂作用。
　　此外本文建立胰岛素抵抗和脂质堆积细胞模型来进一步评价粗壮女贞乙醇提取物不同萃取部位及有效成分改善胰岛素抵抗和脂质堆积的活性。高糖刺激诱导建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型，并用葡萄糖氧化酶法检测样品对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗的影响。利用油酸诱导建立脂质堆积HepG2细胞模型，并用油红O染色法检测样品对脂质堆积HepG2细胞的影响。实验结果表明，在有效浓度范围内，粗壮女贞各提取部位和单体化合物对细胞增殖无明显影响，对HepG2细胞的糖消耗无显著影响。与模型组相比，除石油醚部位外，总提物、乙酸乙酯、正丁醇及水部位均能不同程度提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量和改善油酸诱导的脂质堆积。不同浓度的阿克苷和紫茎女贞苷A、C、D也均表现出对油酸刺激引起的细胞脂质堆积明显的改善作用。因此，粗壮女贞可以改善高糖刺激引起的HepG2细胞胰岛素抵抗和脂质堆积，具有较好的开发前景。
　　为了进一步探究粗壮女贞苯乙醇苷类化合物的生物活性和作用机制，本文设计了虚拟筛选和RNA-seq实验。在虚拟筛选实验中，发现有6个化合物钓到15个靶标，分别与肿瘤、阿尔兹海默症、细菌感染和高胆固醇血症等相关。为了进一步探讨苯乙醇苷化合物对糖脂代谢的影响和机制，利用转录组测序技术探究了阿克苷(AKG)改善脂质堆积HepG2细胞脂类合成代谢的可能机制。
　　结果显示，Control vs Model和Model vs AKG组间出现了大量差异表达基因。经对已知差异基因进行GO功能和KEGG富集分析，发现这些差异表达基因涉及生物过程、分子功能和细胞组分等多个复杂过程，同时富集到多个与脂类代谢合成相关的KEGG通路中。这提示阿克苷可以通过多层次、多途径对脂质堆积HepG2细胞脂类代谢合成进行调控。结合GO功能注释和KEGG pathway富集分析随机挑选SCARB1、SCARB2、ACAT2、DHCR7、FDFT1、LSS、HMGCR、SREBF1和CPT1A基因进行验证，经验证发现，实时定量PCR的结果与RNA-seq测序结果基本一致，说明RNA-seq测序结果是可信的。同时通过对差异基因的验证和注释进一步明确了阿克苷发挥降脂作用可能影响的部分靶点和信号通路，AKG可能通过影响SCARB1、SCARB2、ACAT2、DHCR7、FDFT1、LSS、SREBF1和HMGCR等多个基因的表达改善脂类代谢合成过程，但对CPT1A没有影响，这为粗壮女贞中苯乙醇苷化合物的降脂机制的研究提供了可靠的数据。

目录

声明

缩略词及术语简表

摘要

前言

第一章 绪论

第一节 女贞属植物降脂作用的研究进展

1 粗壮女贞的降血脂作用

2 光萼小蜡的降脂作用

3 总梗女贞的降脂作用

4 女贞子的降脂作用

5 小结

第二节 粗壮女贞中的苯乙醇苷的研究进展

1 粗壮女贞中的苯乙醇苷化合物

2 苯乙醇苷类化合物的生物活性

3 小结

参考文献

第二章 粗壮女贞总苷降脂作用及其基于AMPK通路的降脂作用机制研究

第一节 粗壮女贞总苷的降脂药效学评价

1 材料与方法

2 结果

3 小结

第二节 粗壮女贞总苷基于AMPK通路的降脂作用机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结

第三节 讨论

参考文献

第三章 粗壮女贞及其主要成分改善HepG2细胞胰岛素抵抗和脂质堆积的作用研究

第一节 粗壮女贞及其主要成分改善HepG2细胞胰岛素抵抗作用研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结

第二节 粗壮女贞及其主要成分改善HepG2细胞脂质堆积作用研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结

第三节 讨论

参考文献

第四章 苯乙醇苷改善HepG2细胞脂质堆积作用机制研究

第一节 基于计算机虚拟寻靶技术对粗壮女贞苯乙醇苷类化合物的生物活性评价

1 材料和方法

2 结果

3 小结

第二节 利用转录组测序筛选HepG2细胞脂质代谢相关基因

1 材料和方法

2 结果

3 小结

第三节 虚拟筛选和转录组准确性验证及脂质代谢相关基因表达验证

1 材料和方法

2 结果

3 小结

第四节 讨论

参考文献

第五章 总结

致谢

作者简介