基于转录组分析的绞股蓝氧化鲨烯环化酶的挖掘与鉴定

摘要

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllun(Thunb.)Makino)属于葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，其主要有效成分为绞股蓝皂苷，在叶片中含量最高，目前分离鉴定的绞股蓝皂苷已达160余种。现代药理学研究表明绞股蓝皂苷具有抗肿瘤、抗焦虑、抗动脉粥样硬化、调节免疫力、降血糖、降血脂等多种药理活性。绞股蓝皂苷属于三萜皂苷，因与人参皂苷具有相同或相似的化学结构而备受关注。氧化鲨烯环化酶(OSCs)是绞股蓝皂苷三萜骨架结构合成的关键酶，本研究对绞股蓝OSCs进行了克隆和鉴定，为进一步研究绞股蓝皂苷的合成与调控奠定了基础。
　　植物信号分子茉莉酸甲酯(MeJA)可以诱导绞股蓝皂苷上游合成途径中的法尼基焦磷酸合酶(FPS)和鲨烯合酶(SS)基因上调表达，因此，我们推测参与绞股蓝皂苷合成的OSCs基因也可能受MeJA调控。对MeJA处理0h，6h，12h，24h的绞股蓝叶的转录组进行了Illumina测序，共获取202，535，156条raw reads，采用de novo组装共获得82，073条unigenes。通过基因注释和分类，发现在GO分析中，有22，662个unigenes得到注释，其中有45个基因参与次生代谢，有2，015个基因与代谢调节有关。在KEGG分析中，总共有291个基因与萜类代谢相关，其中有82个基因与萜类骨架合成相关，有42个基因与倍半萜和三萜的生物合成相关。
　　根据序列比对和注释结果，筛选到5个绞股蓝OSCs基因，分别为GpOSC1-5。序列分析发现在5个OSCs中能找到OSCs的保守基序DCTAE，MWCHCR和QW。利用real-time PCR技术对OSCs进行组织特异性和MeJA诱导表达分析，发现GpOSC1在绞股蓝叶中高表达，其余4个基因在茎中表达量最高。MeJA对GpOSC1，4的表达具有抑制作用，GpOSC2，3，5的表达在MeJA处理的初期受到抑制，随后表达量逐渐升高，在处理24小时后表达量达到最高。进化树分析发现GpOSC1属于β-香树脂合酶类;GpOSC2属于环阿屯醇合酶类，与已鉴定的西葫芦(Cucurbita pepo)环阿屯醇合酶具有87.8％的相似性;GpOSC3属于羊毛甾醇合酶类，与丝瓜(Luffa aegyptiaca)的羊毛甾醇合酶具有77.1％的相似性;GpOSC4属于葫芦二烯醇合酶类，与已鉴定的葫芦二烯醇合酶的相似性均大于80％。GpOSC5属于isomultiflorenol合酶类，与丝瓜(Luffa aegyptiaca)中isomultiflorenol合酶的相似性达到82.3％。
　　将基因GpOSC1-5分别克隆到酵母表达载体pYES2中，并转化酿酒酵母麦角甾醇缺陷型菌株GIL77。对外源基因诱导48小时后，离心收集菌体，碱法裂解细胞后用正己烷提取酶的催化产物，通过GC-MS分析，发现GpOSC1能够合成两个特异性产物（产物1和2），GpOSC4能够合成一个特异性产物（产物3）。通过比较保留时间和质谱图，发现这三个产物与标准品达玛烯二醇Ⅱ、羽扇豆醇、葫芦二烯醇、桦木醇和β-香树脂等具有显著差异。通过核磁共振对3个产物的结构解析工作正在进行中。
　　本研究通过转录组测序和基因的异源表达相结合，成功对绞股蓝OSCs进行了功能鉴定，不但为绞股蓝皂苷的代谢工程与合成生物学研究提供了有用的元器件，也为通过分子育种提高绞股蓝皂苷含量提供了有力的理论支撑。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1．1 转录组

1．1．2 转录组测序技术

1．1．3 绞股蓝转录组研究进展

1．2 绞股蓝皂苷合成途径

1．2．1 绞股蓝的主要活性成分

1．2．2 三萜皂苷的生物合成

1．2．3 氧化鲨烯环化酶

1．3 绞股蓝转录组及途径解析研究目的及意义

第二章 研究材料及方法

2．1 材料、试剂与设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 试剂

2．1．3 主要设备

2．2 实验方法

2．2．1 cDNA的获取

2．2．2 实时荧光定量PCR

2．2．3 目的基因获取

2．2．4 目的基因连接到表达载体

2．2．5 目的基因转化酿酒酵母

2．2．6 诱导目的基因表达

2．2．7 产物提取及检测

第三章 结果

3．1．1 预处理及测序数据质量评估

3．1．2 转录本组装

3．1．3 基因功能注释

3．1．4 差异表达分析

3．2 候选OSCs的获取及生物信息学分析

3．2．1 OSCs候选基因的筛选

3．2．2 OSCs生物信息学分析

3．3 OSCs的实时荧光定量PCR分析

3．3．1 OSCs在绞股蓝不同部位的表达分析

3．3．2 MeJA诱导不同时间的OSCs表达分析

3．4 候选OSCs基因在酵母中表达及酶活性检测

3．4．1 表达载体的构建

3．4．2 候选OSCs在酵母中的诱导表达

3．4．3 候选OSCs表达产物的检测

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

缩略词

附录

致谢

作者简介