绞股蓝转录组测序挖掘三萜合成基因与鲨烯合酶正选择位点突变表达载体构建

摘要

文章主要从以下几部分进行论述： 第一部分 绞股蓝转录组测序挖掘三萜合成通路及相关酶基因 目的:通过对绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino，G.pentaphyllum)的根、茎和叶三个部位分别进行转录组测序分析，挖掘绞股蓝三萜合成通路及相关酶基因。使用qPCR技术检验绞股蓝三萜合成通路上呈现部位差异表达的法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，FPS)、鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)和鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase，SE)基因在转录后水平的表达，验证它们在转录组测序分析中的表达规律。同时，使用紫外分光光度法测量三萜皂苷在根、茎和叶三个部位的含量差异，进一步验证FPS、SS和SE在根、茎和叶的表达差异。最后总结绞股蓝FPS、SS和SE表达的部位差异性规律与三萜皂苷含量差异分布规律，为进一步研究绞股蓝三萜合成相关基因表达调控机制做铺垫。 方法:分别提取绞股蓝根、茎和叶三个部位的RNA并进行转录组测序反应，结合KEGG通路数据库查找注释文件当中的绞股蓝三萜合成关键酶基因FPS、SS和SE，寻找三个基因的序列信息和标准化的RPKM表达值。按照|Fold Change|＞2的标准查找差异化基因，总结FPS、SS和SE在根、茎和叶当中的分布差异规律。 PCR克隆出FPS、SS和SE的全长基因片段，稀释成一系列浓度溶液为定量PCR的标准对照品。以绞股蓝根、茎和叶cDNA为定量PCR实验组的模板，探索FPS、SS和SE在根、茎和叶当中的表达规律。 分别提取绞股蓝根、茎和叶中皂苷，使用D101树脂纯化后作为供试品，同时以人参二醇作为对照品，进行显色反应，使用可见光-紫外分光光度仪测量对照品组和供试品组的吸光度值，通过标准曲线法计算绞股蓝根、茎和叶三部位中三萜皂苷的含量，得到绞股蓝根、茎和叶中的三萜皂苷分布差异。 结果:绞股蓝转录组测序分析数据显示三萜合成通路中，FPS、SS和SE三个酶基因相对表达量RPKM的部位差异趋势与qPCR定量部位表达差异趋势相一致，即叶＞茎＞根（叶子表达量为最高）。采用紫外-可见分光光度法测量三萜皂苷，结果表明叶的三萜皂苷含量依次高于茎和根。转录组测序分析、定量表达qPCR实验和三萜皂苷含量测定实验结果存在一致性。 结论:转录组测序分析得到的FPS、SS和SE三个酶基因根＞茎＞叶的差异表达规律在定量表达qPCR实验得到重复，三萜皂苷含量测定实验进一步确认了该规律。绞股蓝FPS、SS和SE三个酶基因的部位差异表达及三萜皂苷的差异性分布将对后续绞股蓝三萜合成通路相关基因的表达与调控机制研究奠定了基础，为靶向提高绞股蓝三萜皂苷含量提供理论依据。 第二部分 绞股蓝鲨烯合酶正选择位点突变表达体构建 目的:结合正选择位点和PCR碱基突变技术，对绞股蓝鲨烯合酶SS进行正选择位点突变，构建野生型和正选择位点突变型的绞股蓝SS原核表达载体和真核表达载体。为后续的SS蛋白正选择位点突变与酶功能关联研究做铺垫，为理解SS结构与功能关系奠定基础。 方法:根据转录组测序分析得到的SS序列设计SS全长扩增引物，PCR扩增出绞股蓝SS序列连接克隆载体并测序，获取绞股蓝SS野生型基因序列。设计合适的目的基因扩增引物，对扩增后目的片段和载体双酶切后再连接，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-SS。使用直接连接法构建原核表达pEASY-E1-SS。使用PCR突变技术分别对pcDNA3.1(+)-SS载体与pEASY-E1-SS载体上SS片段的正选择位点S109、S196、T390和S407进行突变反应，将丝氨酸S或苏氨酸T突变成脯氨酸P，获得野生型和突变型的SS原核与真核表达载体。 结果:绞股蓝SS原核表达载体pEASY-E1-SS和真核表达载体pcDNA3.1(+)-SS构建成功，SS正选择位点突变成功，获得了突变前后的绞股蓝SS原核载体载体与真核表达载体 结论:绞股蓝三萜合成通路SS基因的克隆与正选择位点突变的异源表达载体构建，是下一步研究绞股蓝SS正选择位点与酶活性关联的基础，为研究绞股蓝SS一级结构与功能的关系提供了研究前提。