灵芝鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶基因沉默对灵芝三萜合成及活性氧物质的影响

摘要

灵芝（Ganoderma lucidum）是著名的大型药用真菌，具有极高的药用和保健价值。灵芝三萜以其独特的药理学活性被认为是灵芝的主要药用成分，灵芝三萜含量是目前衡量灵芝药用价值的重要指标。灵芝三萜作为灵芝的次级代谢产物，其含量较低，提高灵芝三萜的含量成为进一步提高灵芝药用价值的重要途径。
　　灵芝三萜类物质的合成是通过甲羟戊酸途径进行的。甲羟戊酸途径是真核细胞中合成甾醇和类异戊二烯的重要途径。甲羟戊酸途径产生的法尼脂焦磷酸通过不同酶的催化可以进入灵芝三萜或类胡萝卜素合成途径。
　　鲨烯环氧酶（Squalene Epoxidase，EC1.14.13.132，SE）是催化鲨烯（Squalene）形成2，3-氧化鲨烯（Squalene2，3-epoxide）的关键酶，是三萜合成途径中的关键酶。八氢番茄红素合酶（Phytoene Synthase，EC2.5.1.32，PSY）是催化两分子的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate）缩合产生八氢番茄红素(Phytoene)的关键酶，八氢番茄红素是类胡萝卜素合成途径中第一个代谢产物。
　　通过基因组序列比对克隆了灵芝鲨烯环氧酶基因Gl-se和八氢番茄红素合酶基因Glpsy的cDNA序列。为考察这两个基因在灵芝三萜合成中的作用，将Gl-se和Glpsy的cDNA序列片段克隆到灵芝基因沉默载体pMi中，利用电击转化法实现了两个基因在灵芝内的基因沉默。结果表明:Gl-se的沉默可以显著降低灵芝三萜含量，三萜合成途径关键酶基因的表达量下降，中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的含量下降，而类胡萝卜素合成途径的产物β-胡萝卜素的含量显著提高。Gl-psy的沉默会导致相反的结果。
　　甾醇类物质和类胡萝卜素在清除体内活性氧的过程中起着重要的作用，参与多种胁迫反应。为探究鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶对灵芝活性氧物质及抗氧化能力的影响。对上述转化子进行活性氧物质相关测定及活性氧胁迫处理，结果表明:与野生型相比沉默转化子本身的活性氧物质含量下降，但抗氧化胁迫的能力没有显著变化。检测过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，发现sei和psyi转化子中过氧化氢酶活性提高，sei转化子超氧化物歧化酶活性降低，psyi转化子超氧化物歧化酶活性提高。

目录

声明

摘要

符号和缩略语说明

第一章 文献综述

1 灵芝及灵芝三萜的研究状况

1．1 灵芝的分类地位

1．2 灵芝的药用价值

1．3 灵芝三萜的研究状况

1．4 灵芝的分子生物学研究

2 鲨烯环氧酶的研究状况

3 类胡萝卜素及八氢番茄红素合酶的研究状况

3．1 类胡萝卜的生理功能

3．2 类胡萝卜素的合成途径

3．3 八氢番茄红素合酶的研究状况

3 本文选题依据

第二章 灵芝鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶基因的克隆及沉默菌株的构建

1 实验材料

2 实验方法

2．1 序列分析

2．2 灵芝总RNA的提取及cDNA制备

2．3 鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶基因序列比对及引物设计

2．4 Gl-se和Gl-psy基因cDNA全长的克隆

2．5 Gl-se和Gl-psy基因沉默载体的构建

2．6 Gl-se和Gl-psy基因沉默载体转化及转化子验证

2．7 实时荧光定量PCR

3 结果与分析

3．1 鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶基因序列的克隆

3．2 鲨烯环氧酶基因序列分析

3．3 八氢番茄红素合酶基因序列分析

3．4 鲨烯环氧酶和八氢番茄红素合酶的表达特性分析

3．4 沉默载体构建

3．5 灵芝沉默转化子的验证

4 小结与讨论

第三章 Gl-se和Gl-psy基因沉默对甲羟戊酸途径代谢产物及活性氧物质的影响

1 实验材料

2 实验方法

2．1 固体培养菌落生长及观察

2．2 菌丝液体培养及观察

2．3 蛋白质含量测定

2．4 过氧化氢测定

2．5 过氧化氢酶(CAT)的活性测定

2．6 超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定

2．7 转化子中灵芝三萜含量的测定

2．8 类胡萝卜素含量的测定

2．9 鲨烯、羊毛甾醇含量的测定

2．10 关键酶基因表达情况

3 结果与分析

3．1 沉默转化子生长速度及抗氧化胁迫能力测定

3．2 沉默转化子活性氧物质测定

3．3 液体培养菌丝观察及活性氧相关测定

3．4 灵芝沉默转化子灵芝三萜含量的测定

3．5 灵芝沉默转化子鲨烯、羊毛甾醇及类胡萝卜素含量测定

3．6 灵芝三萜合成关键酶基因的表达情况

4 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢