第一部分 PHLDA3基因失活导致肿瘤发生及临床意义；第二部分 胰腺神经内分泌肿瘤中YY1基因热点突变

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 PHLDA3基因失活导致肿瘤发生及临床意义
　　目的:课题组既往的研究发现胰腺神经内分泌肿瘤(pancreaticneuroendocrine tumors, PNETs)频繁发生染色体1q31-32区域的杂合性缺失(lossof heterozygosity, LOH)，该区域内存在PHLDA3基因，日本学者发现在小鼠PHLDA3基因敲除模型中有胰岛增生。因此，本课题的研究目的是:PHLDA3基因敲除能否导致大鼠PNETs发生，人类PNETs中是否在PHLDA3基因异常和表达缺失，从而阐明散发性PNETs发生的分子机制。同时明确该基因蛋白表达是否具有判断预后的价值。
　　方法:利用免疫组化的方法测定222例PNETs组织和109例PNETs瘤旁组织中PHLDA3蛋白的表达，然后分析蛋白表达与患者的临床病理特征和预后的关系。利用甲基化特异性PCR测定PHLDA3基因启动子甲基化状态。利用微卫星标记检测PHLDA3基因是否存在LOH。采用CRISPR/Cas9技术构建PHLDA3基因敲除的SD大鼠模型，繁殖并进行基因型鉴定，分别在6月、12月、18月时处死大鼠，观察是否有肿瘤形成;取得胰腺等腺体组织，石蜡包埋后切片、HE染色，分析基因敲除大鼠和野生大鼠胰岛数量和面积的变化;留取空腹血清，测定血糖、胰岛素水平，分析PHLDA3基因敲除对糖代谢影响。
　　结果:PHLDA3在未发生转移的PNETs中表达率较高(28.5％vs.17.9％，P=0.078)，PHLDA3蛋白阳性表达的PNETs患者的预后较好（总生存:N=187，P=0.026;无病生存:N=187，P=0.024），生存时间较长（总生存:N=187，Log RankP=0.017;无病生存:N=182，Log Rank P=0.041）。PNETs及其瘤旁组织中存在高比例的PHLDA3基因启动子甲基化（分别为12/19和3/6），统计结果显示甲基化与蛋白表达无关。25.7％的PNETs存在PHLDA3基因LOH，发生LOH的肿瘤中PHLDA3蛋白表达率低(21％ vs.52％，P=0.098)。PHLDA3基因敲除的大鼠可形成PNETs，PHLDA3基因敲除大鼠的胰岛形态和大小与野生型大鼠差别不大，然而基因敲除的雄性大鼠血糖水平较低(6.23 mmol/L vs.11.07 mmol/L，P=0.018)。
　　结论:敲除PHLDA3基因的SD大鼠发生PNET，而基因野生型的对照大鼠则无PNETs生成。提示PHLDA3基因是PNETs的抑癌基因。人类PNETs中存在PHLDA3基因的杂合性缺失和基因启动子甲基化，同时瘤组织中PHLDA3蛋白表达减少或丢失。提示部分人类PNETs的发生和PHLDA3基因失活相关。
　　第二部分 胰腺神经内分泌肿瘤中YY1基因热点突变
　　目的:胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumors，PNETs)是一组少见的异质性的肿瘤，年发病率约0.94-1.27/10万人，但是其发病率呈逐年上升趋势。我国的学者首次报道了30％的胰岛素瘤中存在YY1 T372R热点突变，然而该基因突变与蛋白表达在胰岛素瘤中的临床意义尚不明确，特别是该基因突变在其他PNETs亚型中是否发生未见报道。
　　方法:在138例PNETs中对YY1基因热点突变进行一代测序，其中包括75例胰岛素瘤，19例功能性非胰岛素瘤PNETs和44例无功能PNETs。用免疫组化染色测定103个PNETs和29例配对瘤旁组织中YY1蛋白表达，用western bolt对4例PNETs、1例配对瘤旁胰腺组织和3例正常胰腺组织验证YY1蛋白表达。统计分析YY1突变和蛋白表达的临床病理意义。
　　结果:测序结果显示19％(14/75)的胰岛素瘤和1.5％(1/67)的非胰岛素瘤PNETs存在YY1T372R突变，表明YY1基因热点突变为胰岛素瘤所特有(P=0.001)。发生YY1T372R突变的患者年龄较大（57.5岁vs.43岁，P=0.006）。Y1T372R突变与胰岛素瘤的良恶性以及肿瘤分期、分级均无关，提示该突变是肿瘤发生的早期事件。的研究还发现出现YY1T372R突变的患者胰岛素水平较低和胰岛素释放指数下调(N=69，P=0.015和N=69，P=0.073);此外，O型血的胰岛素瘤患者发生YY1热点突变的比例明显高于其他血型患者(38.9％ vs.13.2％，P=0.018)。YY1T372R突变不影响蛋白表达。YY1蛋白广泛表达于PNETs和瘤旁胰腺组织的胞核中，但是同瘤旁组织相比，PNETs中YY1的表达显著上调。YY1蛋白在男性患者中的表达较高(88.1％vs.72.1％，P=0.052)，在良性PNETs中表达较高(82.7％ vs.63.6％，P=0.053)，YY1高表达的患者体重指数较低(27.9 vs.29.3，P=0.010)，Kaplan-Meier生存分析显示YY1高表达的患者总生存和无病生存的时间均延长（总生存:N=71，Log RankP=0.006;无病生存:N=68， Log Rank P=0.009），Cox模型显示YY1表达上调的患者预后好(总生存:HR15.643，95％CI1.635-149.685，P=0.017;无病生存:HR3.162，95％CI0.830-12.047,P=0.092)。
　　结论:YY1T372R热点突变在胰岛素瘤中特异存在，O型血的胰岛素瘤患者中较为多见。该突变可能是肿瘤发生的早期事件，可能影响胰岛素的分泌。YY1 T372R突变不影响蛋白表达。YY1在PNETs中表达上调提示患者预后较好。

目录

声明

缩略语

第一部分 PHLDA3基因失活导致肿瘤发生及临床意义

摘要

前言

研究对象

技术路线图

实验材料

一、试讽剂刑类矢

二、耗材类

三、主要仪器

四、生物信息学软件及网络资源

实验方法

一、临床病理资料的收集

二、患者随访

三、PHLDA3蛋白免疫组织化学染色和结果判断标准

四、测定PHLDA3基因启动子甲基化的DNA制备

五、甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)测PHLDA3基因启动子甲基化状态

六、测定PHLDA3基因杂合性缺失(loss of heterogenecity，LOH)

七、构建PHLDA3基因敲除大鼠

八、大鼠处理和取材

九、组织石蜡包埋、切片、HE染色和扫描

十、HE染色切片的全景扫描与分析

十一、大鼠胰腺石蜡切片免疫组化染色

十二、大鼠血糖、胰岛素测定

十三、统计分析

实验结果

一、PNETs患者和肿瘤标本的临床病理特点

二、PHLDA3蛋白在PNETs中的表达

三、PHLDA3蛋白表达与患者临床病理特征以及预后的关系

四、PNETs存在PHLDA3基因启动子甲基化

五、PNETs存在PHLDA3基因杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)

六、PHLDA3基因敲除大鼠的繁殖和基因型鉴定

七、实验大鼠的基本信息

八、大鼠胰岛的形态学观察

九、PHLDA3基因纯合敲除的SD大鼠形成PNETs

十、SD大鼠形成的腹壁肿瘤

十一、大鼠胰岛的计数和计量分析

十二、PHLDA3基因敲除对大鼠血糖、胰岛素水平的影响

讨论

结论

参考文献

第二部分 胰腺神经内分泌肿瘤中YY1基因热点突变

摘要

前言

研究对象

实验材料

一、试讽剂刑类矢

二、耗材类

三、主要仪器

四、生物信息学软件及网络资源

实验方法

一、临床病历资料的收集和患者随访

二、DNA提取

三、YY1热点突变位点PCR扩增与测序

四、YY1蛋白免疫组织化学染色

五、统计分析

实验结果

一、PNETs患者的临床病理特点

二、YY1T372R突变在PNETs亚类中的分布

三、胰岛素瘤中YY1热点突变的临床病理特点

四、YY1在PNETs中表达上调

五、YY1蛋白表达与PNETs临床病理特点的关系

六、YY1T372R突变不影响蛋白表达

讨论

结论

参考文献

附表

论文综述 胰腺神经内分泌肿瘤的基因分子生物学进展

致谢

个人简历