顺铂处理对几种癌细胞中Bcl--2家族7种基因mRNA选择性剪接的影响

摘要

肿瘤是机体组织细胞异常增生而形成的，它的无限制性生长是细胞凋亡过程受到抑制的结果，肿瘤的发生与发展离不开细胞凋亡的异常。细胞凋亡障碍虽然能够促发肿瘤，但反过来它同样可以成为治疗肿瘤的靶标。在化疗药物对癌细胞的杀伤作用中很重要的一点就是诱导了癌细胞自身的凋亡。在细胞凋亡中多数参与凋亡的基因都存在mRNA选择性剪接异构体(Splicing isoform)，这些异构体所表达出的蛋白产物是影响凋亡的关键因素之一。这些基因的mRNA剪接变化有的可以促进凋亡的发生，有的也可以起到抑制作用。已有研究表明：癌细胞在化疗药物处理后，许多基因特别是与细胞周期和凋亡相关基因的mRNA均会发生剪接变化，而许多化疗药物主要是造成DNA损伤从而引发线粒体介导的凋亡途径导致细胞死亡。那么癌细胞在化疗药物处理后，与线粒体凋亡途径相关基因的mRNA剪接会发生怎样的变化呢？本研究选取了与该途径密切相关的Bcl-2家族部分基因作为研究对象，分析在经典化疗药物顺铂处理癌细胞后其mRNA选择性剪接的变化。 目的： 研究分析在化疗药物顺铂处理下，多个肿瘤细胞中Bcl-2家族部分基因(BcI2A1、Bad、Bak、Bcl2L12、Bc-X、Bok、Bim)mRNA选择性剪接变化及其规律。 方法： 用梯度浓度的顺铂处理肺癌细胞(A549、H1299)、宫颈癌细胞(SiHa、Caski、C33A)5种细胞24小时后，提取各细胞的总RNA，用半定量RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳及凝胶图像分析软件检测分析各基因mRNA异构体的组成以及其比例和相对水平的变化，并进行统计学分析。 结果： (1)Bcl2A1（抗凋亡）：检测到两种异构体，分别为a(137bp)和b(81bp)。在A549中两种异构体的比例没有明显变化，但两者的转录相对水平及总mRNA量都随顺铂处理浓度升高而有所增加;在H1299中两种异构体的比例与转录相对水平都没有明显变化。 (2)Bad基因（促凋亡）：只检测到了1种异构体，并且在转录相对水平上都没有明显的变化。 (3)Bak基因（促凋亡）：只检测到了1种异构体，并且在转录相对水平上都没有明显的变化。 (4)Bcl2L12基因（抗凋亡）：检测到了2种异构体，分别为a(426bp)和b(153bp)，在A549中两种异构体的比例与转录相对水平都没有明显变化;在H1299中异构体a的比例上升，b的下降，转录相对水平也是a的上升，b的下降，mRNA总量也在下降。 (5)Bcl2-X基因：检测到了2种异构体，分别为抗凋亡的Bcl2-XL(351bp)和促凋亡的Bcl2-XS(162bp)。在A549及H1299中都表现为Bcl2-XL的比例下降和Bcl2-XS的比例上升，而转录相对水平方面都没有明显改变。 (6)Bok基因（促凋亡）：只检测到了1种异构体，在A549中，该异构体的转录相对水平没有明显变化，但在H1299中，该异构体的转录相对水平是有所下降的。 (7)Bim基因（促凋亡）：检测到了BimEL、BimL、BimS、Bimα2、Bimα4和Bimβ7共6种Bim基因mRNA剪接异构体，在顺铂处理下，它们的组成比例和相对水平都发生了相应的变化，主要表现为随着顺铂处理浓度的增高，5种细胞中BimL异构体所占比例和转录相对水平都有明显的增加。 结论： 在顺铂处理下，Bcl-2家族里一些与凋亡相关基因的剪接和转录相对水平发生了相应变化并共同促进细胞凋亡的发生，其中促凋亡的重要基因Bim通过转录和mRNA选择性剪接两种机制在RNA水平上上调其表达，从而促进凋亡，BimL是主要被上调的异构体。

目录

摘要

一、前言

1．肿瘤

2．肿瘤化疗

3．铂类化疗药物

4．细胞凋亡

5．Bcl-2家族与细胞凋亡

6．唯BH3域蛋白

7．Bcl-2蛋白家族与肿瘤治疗

8．选择性剪接与肿瘤、细胞凋亡

二、研究对象

1．实验划分

2．目标基因简介

三、实验材料

1．实验细胞

2．细胞培养

3．细胞处理药物

4．主要实验试剂

5．主要实验仪器

6．分析软件

四、实验方法

1．培养细胞

2．化疗药物顺铂处理细胞

3．总RNA提取

4．逆转录

5．用PCR引物进行PCR扩增检测

6．PeR产物琼脂糖凝胶电泳检测

7．凝胶成像与数据采集

8．统计学分析

五、实验检测与分析数据

第一部分实验

1．Bcl2A1基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

2．Bad基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

3．Bak基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

4．Bcl2L12基因mRNA剪接异构体检测与分析

5．Bcl-X基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

6．Bok基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

7．Bim基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

第二部分实验

1．检测Bim基因mRNA剪接异构体

2．Caski中Bim基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

3．SiHa中Bim基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

4．C33A中Bim基因mRNA剪接异构体检测与分析数据

六、结果与结论

1．结果

2．结论

七、讨论

参考文献

缩略词表

致谢

研究生简历

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