顺铂诱导人肾小管细胞凋亡过程中microRNA表达谱筛选及HIPK2对该凋亡的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 建立顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HKC细胞)凋亡模型
　　目的：建立顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型，选定下一步实验合适的顺铂浓度。
　　方法：向对数增长期的HKC细胞加入顺铂使其在培养液浓度分别为2、10和50μM，对照组为同样条件培养不加药组。检测HKC细胞存活率及凋亡率。
　　结果：HKC细胞存活率随顺铂浓度升高下降，凋亡率随顺铂浓度升高而升高。
　　结论：成功建立顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型;并将10μM顺铂确定为下一步实验所需浓度。
　　第二部分 顺铂诱导HKC细胞凋亡中microRNA表达谱及生物信息学分析
　　目的：筛查顺铂诱导HKC细胞凋亡的microRNA差异表达谱及mRNA差异谱，结合生物信息学方法筛选靶基因及构建Pathway-network，miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network。进一步确定在顺铂诱导HKC细胞凋亡中发挥重要作用的microRNA。
　　方法：利用Affymetrix Gene Chip miRNA芯片进行差异表达microRNA的筛选，分析获得microRNA差异表达谱;同时利用Affymetrix U133基因表达芯片筛选差异表达mRNA。microRNA靶基因数据库筛选差异microRNA靶基因，联合基因表达芯片结果进一步确定microRNA靶基因。生物信息学分析推测差异表达的microRNA可能具有的生物学功能及参与的机制通路，然后基于microRNA对靶基因的负向性调控， 构建Pathway-network， miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network。根据以上网络，确定在顺铂诱导HKC细胞凋亡中发挥重要作用的miRNAs。
　　结果：差异表达的miRNAs聚类分析图结果显示各组组内的样本一致性较好。与对照组相比，实验组microRNA表达差异显著(p＜0.05)，共筛选出差异性表达的microRNA 47条;Affymetrix U133基因芯片筛选出差异表达基因共3831条。利用microRNA靶基因数据库筛选出差异microRNA的靶基因4760个，与基因芯片结果取交集后最终得到靶基因1181个，如ARHGEF4和BNC2等。进一步通过生物信息学方法得到分析网络:Pathway-network，miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network，对network进一步分析得出可能在顺铂诱导的HKC细胞凋亡发挥重要作用的microRNAs，如miR-9-3p和miR-371 b-5p。
　　结论：经顺铂诱导的HKC细胞microRNA表达谱与对照组相比有明显差异;miR-9-3p，miR-371b-5p可能在顺铂诱导的HKC细胞凋亡中发挥作用。
　　第三部分 HIPK2对顺铂诱导的HKC细胞凋亡的影响
　　目的：探讨HIPK2对顺铂诱导的HKC细胞凋亡的影响。
　　方法：首先构建顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型，实时荧光定量PCR和Western blot检测HIPK2在不同浓度顺铂诱导的HKC细胞凋亡过程中的表达。其次，设计合成两条HIPK2 siRNA干扰片段，通过脂质体转染HKC细胞，建立HIPK2干扰的细胞株，实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测HIPK2 mRNA和蛋白的表达，再用顺铂处理细胞，Annexin Ⅴ/PI检测细胞凋亡情况。最后，Westernblot检测干扰HIPK2对凋亡相关蛋白bax表达的影响。
　　结果：顺铂诱导的HKC细胞凋亡过程中HIPK2 mRNA和蛋白表达水平均明显下调(p＜0.05)，且随着顺铂浓度增高HIPK2表达逐渐降低。转染小干扰RNA后可显著降低HIPK2在HKC细胞内mRNA和蛋白的表达，且HIPK2表达降低后会促进顺铂诱导的HKC细胞凋亡。
　　结论：HIPK2可抑制顺铂诱导的HKC细胞凋亡。

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摘要

缩略词

1 前言

2 材料与方法

3．结果

4 讨论

第二部分 顺铂诱导HKC细胞凋亡中microRNA表达谱及生物信息学分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三部分 HIPK2对顺铂诱导的HKC凋亡的影响

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4 讨论

参考文献

综述 与AKI相关的miRNA的研究进展

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