一、SALL4在恶性滋养细胞肿瘤中的功能机制研究以及基于CTC平台的临床应用；二、熔解曲线分析在B细胞淋巴瘤IGH基因重排检测中的临床应用研究

摘要

本论文主要分两部分，第一部分旨在探究干细胞因子SALL4对恶性滋养细胞功能的影响并基于循环滋养细胞水平探究恶性滋养细胞肿瘤患者中SALL4的表达情况。培养胎盘绒毛膜癌来源的SALL4高表达恶性滋养细胞系JAR，用慢病毒表达载体分别建立SALL4稳定敲低和SALL4稳定过表达的恶性滋养细胞。CCK-8细胞增殖实验、Transwell体外侵袭和迁移实验结果显示SALL4敲低显著减弱了恶性滋养细胞JAR的增殖、侵袭迁移能力，而SALL4过表达则进一步增强了JAR的增殖、侵袭迁移能力。采用流式细胞术分析SALL4敲低JAR以及阴性对照细胞的周期分布，结果显示SALL4敲低的JAR细胞发生了G0/G1期阻滞。Western blot和实时荧光定量PCR结果显示SALL4敲低的恶性滋养细胞中c-Myc、MMP2、CCND1、β-catenin的蛋白和RNA表达均下调。采用微过滤结合RNA FISH法进行CTC富集分析并进一步检测单个CTC中SALL4表达，结果显示恶性滋养细胞肿瘤患者CTCs总数、混合型CTCs和间质型CTCs数量要显著高于正常早孕组，ROC分析结果显示三个指标最大曲线下面积(AUC)分别为0.776(p=0.001)、0.719(p=0.012)和0.695(p=0.025)。SALL4高表达CTCs在正常早孕组和良性滋养细胞疾病组中无检出，而在恶性滋养细胞肿瘤患者中检出率达31.6％(6/19)。因此得出结论，SALL4在恶性滋养细胞中具有促癌作用，并可能通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路调控c-Myc、CCND1、MMP2的表达，发挥促进绒癌细胞增殖、侵袭转移的作用。本研究首次在滋养细胞疾病患者中研究CTC在恶性滋养细胞肿瘤辅助诊断中的应用价值，表明CTCs在恶性滋养细胞肿瘤和正常早孕人群中的数量有显著差异，并具有较好的诊断效能，提示其可作为β-hcg的补充标志物。基于CTCs水平首次在恶性滋养细胞肿瘤患者中发现SALL4高表达CTCs，为SALL4参与恶性滋养细胞肿瘤发生发展提供新的临床线索。 第二部分研究中将BIOMED-2引物系统中FR2家族引物应用到熔解曲线分析，联合FR2和FR3家族引物检测免疫球蛋白重链(IGH)基因重排，并评价改良方法在B细胞淋巴瘤中的临床应用。收集40例B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的存档石蜡包埋组织、31例反应性淋巴细胞增生患者的石蜡包埋组织，合成BIOMED-2系统中针对IGH重排检测的FR2家族引物七条和FR3家族引物七条以及共同下游引物JH一条，采用含SYBR Green染料的PCR预混体系通过LightCylcer荧光定量PCR仪检测，并用传统BIOMED-2体系聚丙烯凝胶(PAGE)电泳技术和毛细管电泳技术进行验证。结果显示，31例反应性增生标本检测结果均为阴性，特异性为100％。改良方法联合FR2和FR3两家族引物在40例B淋巴瘤石蜡包埋组织标本中共检测出28例克隆性重排，敏感性为70％(28/40)，比单独使用FR3家族引物灵敏度提高12.5％;同时采用PAGE法对40例B淋巴瘤石蜡包埋组织标本进行检测，结果显示熔解曲线分析和PAGE法的一致性为95％;对2例PAGE法检测无法判读结果而熔解曲线分析检测为阳性的样本进行毛细管基因扫描，结果显示这两例样本均为阳性，与熔解曲线分析检测结果一致;将Ramos细胞系用反应性增生DNA倍比稀释后检测，显示改良方法的最低检测限可达3.125％。综上所述，改良熔解曲线检测IGH基因重排，结果可靠，检测快速灵敏、通量较高，且有效避免了产物暴露造成的污染，有望成为克隆性重排检测的新选择。

目录

表索引

图索引

英文缩略词

摘要

第一部分SALL4在恶性滋养细胞肿瘤中的功能机制研究以及基于CTC平台的临床应用

前言

材料和方法

实验结果

一、敲低SALL4表达使JAR细胞增殖能力、侵袭、迁移能力减弱

二、SALL4过表达使JAR细胞增殖能力、侵袭、迁移能力增强

三、SALL4对恶性滋养细胞JAR细胞周期的影响

四、敲低SALL4对细胞侵袭和增殖相关基因、EMT相关基因以及信号通路相关基因表达的影响

五、正常早孕妇女和滋养细胞疾病患者外周血循环滋养细胞检测情况

六、CTCs／CTBCs在恶性滋养细胞肿瘤患者中的检出数量显著高于正常早孕

七、CTC与恶性滋养细胞肿瘤临床特征相关性

八、SALL4阳性CTCs在各类滋养细胞疾病中的检出情况

九、SALL4表达在上皮型、混合型和间质型CTC中无显著性差异

讨论

结论

不足与展望

第二部分熔解曲线分析在B细胞淋巴瘤IGH基因重排检测中的临床应用研究

前言

材料和方法

一、熔解曲线分析方法学建立

二、改良熔解曲线法对B细胞淋巴瘤的临床诊断效能

三、改良熔解曲线分析与传统聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管基因扫描技术对比

四、改良熔解曲线法最低检测限

五、改良熔解曲线法的重复性

六、改良熔解曲线法的分辨率

七、改良熔解曲线法在外周血样本中的应用

讨论

结论

不足与展望

参考文献

附录

基金资助

已发表与学位论文相关的论文

综述 干细胞因子SALL4在恶性肿瘤中的研究进展

致谢

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