脊髓灰质炎病毒2C蛋白的结构与功能研究

摘要

脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)是脊髓灰质炎的病原体，可侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞。PV属于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus，EV），它的基因可以编码一个约250kDa的前体蛋白(polyprotein)。病毒前体蛋白被自身的蛋白酶2A和3C切割形成11个成熟的具有功能的蛋白，其中包括4种结构蛋白（衣壳蛋白）：VP0，VP1和VP3，以及7种非结构蛋白：2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D。 非结构蛋白2C及其前体蛋白2BC介导了病毒感染的细胞中膜组分的变构与基于膜结构的病毒复制复合物的组装，此外，还参与了包括病毒的脱衣壳、天然免疫逃逸和病毒衣壳的形成等病毒生命周期中的重要过程。2017年关洪鑫博士等解析了EV712C116-329的结构，这项研究成果填补了多年来2C结构信息方面的空缺。 本课题成功解析了PV2C116-329的2.55(A)的高分辨率晶体结构，这是我们继EV71后解析的第二个微小核糖核酸病毒科的2C蛋白结构。解析的2C蛋白结构当中包含三个subdomain：ATPase结构域，锌指结构域和一个长的C末端两亲性α螺旋（或pocket binding domain，PBD）。其中ATPase结构域和锌指结构域之间的疏水氨基酸形成了一个疏水性的“口袋(pocket)”。这两个结构的不同之处在于锌指结构的构造，EV71的锌指有三个配体，而PV的锌指结构有四个配体。与EV712C蛋白的结构相似的是，PV2C的C末端两亲性α螺旋通过疏水相互作用与相邻的一个2C蛋白的疏水性“口袋”相互结合，在晶体中同样是以多聚体的形式存在;与此同时分子筛柱层析的实验结果表明PV2C在溶液中是以四聚体的形式存在的。我们挑选了参与构成三个结构域的关键氨基酸进行单点突变，检测其突变体的ATPase酶活性，结果表明这种寡聚化形式是2C蛋白发挥ATPase活性的结构前提。我们知道AAA+ATPase超家族的蛋白通常会形成环状六聚体结构来行使功能，2C蛋白属于该家族成员，并且电镜学研究也表明2C蛋白可以形成环状结构，因此我们推测PV2C也会形成环状六聚体结构。我们以SV40Large T Antigen(LTAg)的六聚体为模版，参考EV712C116-329的六聚体模型，模拟构建了PV2C的六聚体模型。并且我们以该模型为模版，把之前发现的所有的与功能相关的位点以及抑制剂抗性位点都定位到了这个六聚体模型上，这便为进一步深入探讨2C的功能提供了重要的结构生物学基础，同时这个研究成果也将为设计靶向2C抑制剂研发提供了重要的科学依据。

目录

声明

摘要

前言

1微小RNA病毒

1．1病毒粒子特征

1．2基因组特征

2 2C蛋白的研究现状

2．1 2C蛋白简介

2．2 EV71 2C

3脊髓灰质炎病毒

立题依据

实验材料和方法

1材料与仪器

1．1菌株和细胞系

1．2质粒

1．3常用试剂、耗材和仪器设备

1．4常用溶液配制

2实验方法

2．1序列分析

2．2克隆构建

2．3蛋白表达与纯化

2．4ATPase实验

2．5 EV71重组病毒复制能力的检测

2．6圆二色谱实验

实验结果

1重组质粒构建

2蛋白表达纯化

3晶体筛选和优化

4结构与功能分析

4．1突变体与native的比较

4．2 PV 2C 116-329的结构特征

4．3 PV 2C 116-329寡聚化

4．4 2C蛋白的六聚体模型

4．5锌指结构的探究

讨论

1 EV71 2C和PV 2C结构的异同

2锌指的分类

3药物设计启发

总结

参考文献

缩略词表

致谢

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