长非编码RNA Linc--RAM通过调控糖原磷酸化酶活性促进骨骼肌细胞分化

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 长非编码RNA Linc-RAM通过调控糖原磷酸化酶活性而促进骨骼肌细胞分化 深入系统地研究长非编码RNA的生理功能并揭示其发挥功能的分子机制是当前RNA研究领域的核心科学问题之一。目前，对于长非编码RNA的研究主要集中于细胞核定位的lncRNA，而鉴定到细胞质定位的lncRNA还不多，对其分子机制研究还不深入。本研究团队前期鉴定到一个受MyoD调控的骨骼肌组织特异表达的长非编码RNA—Linc-RAM。分子机制研究表明:细胞核内Linc-RAM通过直接结合MyoD调控骨骼肌细胞分化。进一步的探究发现，Linc-RAM在细胞核和细胞质中均有分布。然而，细胞质中Linc-RAM是如何发挥功能的并不清楚。因此本文的科学问题是探索细胞质中Linc-RAM促进骨骼肌细胞分化的分子机制。 为此，首先采用了RNA pull-down结合质谱的方法鉴定Linc-RAM在细胞质中的结合蛋白。在几个候选蛋白分子中，感兴趣的是糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase，PYGM)。随后，利用RIP(RNA immunoprecipitation)实验验证了细胞质中Linc-RAM的确与PYGM结合。EMSA(Electrophoresis mobility shift assay)和BIAcore(Biomolecular Interaction Analysis)实验进一步验证了两者的直接结合。有趣的是，发现PYGM的表达随着骨骼肌细胞分化而上调，这提示PYGM可能参与骨骼肌细胞分化。深入研究表明，过表达PYGM促进骨骼肌细胞分化，敲低PYGM的表达则抑制骨骼肌细胞分化;实际上，当阻碍了PYGM酶活性后，骨骼肌细胞的分化受到抑制。更进一步地，发现敲低PYGM表达后，Linc-RAM不再促进细胞分化，这表明骨骼肌细胞的分化需要Linc-RAM与PYGM共同作用。分子机制上，发现Linc-RAM调控PYGM酶活性，因此细胞质中Linc-RAM促进骨骼肌细胞分化是通过调控糖原磷酸化酶PYGM活性实现的。然而，PYGM是如何促进骨骼肌细胞分化的呢？干扰Linc-RAM及PYGM的表达后，通过分析糖原代谢通路、糖酵解代谢通路以及磷酸戊糖途径关键酶的变化，最终推测果糖-1，6二磷酸(FDP)在Linc-RAM/PYGM介导的细胞分化中发挥了关键作用。这一想法正在验证中。 目前，长非编码RNA对细胞代谢调控的研究还比较少。深入研究长非编码RNA调控细胞代谢的生理功能具有一定的创新性。而本文鉴定到的细胞质中与Linc-RAM结合的蛋白分子糖原磷酸化酶PYGM，有望揭示细胞质中长非编码RNA与代谢酶相互作用调控细胞分化的新机制。 第二部分 miR-127靶向调控S1PR3的表达促进骨骼肌细胞分化 近来的研究表明微小RNA (microRNAs)调控骨骼肌干细胞功能。已有报道表明miR-127在骨骼肌组织中过表达，但是miR-127在骨骼骨骼肌细胞分化以及肌肉组织损伤再生过程中的作用还不清楚。本研究发现，miR-127随着骨骼骨骼肌细胞分化而表达上调;在骨骼骨骼肌细胞中过表达miR-127则促进骨骼肌细胞分化。为了进一步研究miR-127在骨骼肌发育和损伤再生中的作用，我们制备了miR-127的转基因小鼠。与野生型小鼠相比，miR-127转基因小鼠骨骼肌损伤再生的速度加快;进一步研究表明miR-127是通过促进骨骼肌干细胞分化从而加快骨骼肌组织损伤再生的。分子机制上，我们筛选到了一个G蛋白偶联受体磷酸鞘氨醇-3受体S1PR3(sphingosine-1-phosphate receptor 3)作为miR-127的靶基因。研究结果表明，miR-127是通过调控S1PR3的表达促进骨骼骨骼肌细胞分化的。重要的是，我们还发现过表达miR-127显著缓解了mdx小鼠（人类肌营养不良小鼠模型）的肌营养不良表型。因此，miR-127可能作为治疗人类骨骼肌疾病的潜在靶点。

目录

第一部分长非编码RNA Line-RAM通过调控糖原磷酸化酶活性而促进骨骼肌细胞分化

摘要

第1章文献综述

1．1长非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)在骨骼肌细胞增殖、分化中的研究进展

1．2细胞代谢对骨骼肌细胞增殖、分化的调控

1．3糖原代谢在细胞激活、增殖和分化中的作用

1．4本文的科学问题与研究内容

2．1 实验材料

2．2实验方法

第3章实验结果

3．1 Line-RAM与糖原磷酸化酶PYGM直接结合

3．2 Line-RAM通过与糖原磷酸化酶PYGM的结合促进骨骼肌细胞分化

3．3 Line-RAM增强糖原磷酸化酶PYGM的酶活性

3．4 Glycogen shunt可能参与调控Linc-RAM／PYGM介导的骨骼肌细胞分化

第4章讨论

第5章总结

参考文献

第二部分miR-127靶向调控S1PR3的表达促进骨骼肌细胞分化

摘要

第1章背景

第2章材料与方法

2．1实验材料

2．2实验方法

第3章实验结果

3．1 miR-127促进骨骼肌细胞分化

3．2 miR-127靶向调控S1PR3的表达

3．3 miR-127缓解mdx小鼠的肌营养不良表型

第4章讨论

个人简历

致谢

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