CD169在HIV--1/SIV感染单核细胞中的作用研究

摘要

艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的。HIV-1主要感染CD4+T细胞，破坏人体的免疫系统，导致免疫系统失去抵抗力，从而引发各种机会性感染。高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出现，延缓了大多数感染者的发病时间，使死亡率大幅下降，但是，该方法却不能清除潜伏感染细胞中的HIV-1，主要包括静息CD4+T细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。单核巨噬细胞可以抵抗病毒诱导的细胞凋亡，而成为HIV-1病毒复制和潜伏的重要场所。不仅如此，感染HIV-1的单核巨噬细胞可以将病毒传递给CD4+T细胞，促进了HIV-1的潜伏感染和潜伏库的扩大。 近年来的研究发现，在HIV-1感染早期，外周血单核细胞即可高表达CD169，CD169可以与HIV gp120上的唾液酸结合，促进病毒与细胞的结合。为了研究CD169在HIV-1感染单核细胞中的作用，我们进行了以下三部分的研究。 第一部分：SIV感染猴外周血CD14+单核细胞CD169分子表达的变化。CD169，也被称作Siglec-1，是第一个被发现的唾液酸黏附素(Siglecs)家族的成员，主要表达于单核巨噬细胞和树突状细胞。CD169可与病毒表面的某些糖蛋白结合，增强病毒与细胞的结合。HIV-1研究中发现，机体感染HIV-1后，外周血单核细胞高表达CD169。那么，SIV感染的恒河猴外周血单核细胞是不是也会高表达CD169? 本部分主要研究了正常恒河猴感染前后外周血单核细胞比例及其表面分子CD169表达量的变化。 结果显示，SIVmac239感染正常恒河猴后，CD14+单核细胞的比例下降，CD14+单核细胞表面分子CD169表达量升高;外周血中不同单核细胞亚群CD169的表达量均显著增加，CD14+CD16-+单核细胞中CD169表达量的升高更为明显。以上实验结果表明SIVmac239病毒感染恒河猴后，可引起外周血单核细胞CD169分子表达量的升高。 第二部分：CD169分子对HIV-1病毒内化作用的研究。CD169与HIV gp120上的唾液酸结合介导了病毒与细胞的吸附。pCD169与PRRSV病毒表面的唾液酸结合从而介导了细胞对病毒的内化。已有研究证明，单克隆抗体的Fab段可诱导hCD169的内化作用，那么，CD169与HIV gp120上唾液酸的结合是否能引起病毒的内化？ 本部分研究通过将表达CD169的细胞与病毒吸附后共培养，激光扫描共聚焦显微镜观察CD169和HIV gag-iGFP病毒的定位。 结果显示，转染的CHO-K1细胞可表达CD169分子，吸附结束后，可在细胞表面观察到病毒颗粒;细胞与病毒共培养后，可观察到表达CD169分子的部分细胞内有病毒颗粒，随着培养时间的延长，细胞内病毒颗粒逐渐减少至完全观察不到。使用HIV gag-iGFP病毒分别感染THP-1/IFN-α-THP-1细胞，感染后，实时荧光定量PCR检测细胞内HIVp24基因的表达。 结果显示，HIV gag-iGFP感染的IFN-α-THP-1细胞中HIV p24的表达量显著高于THP-1细胞。上述实验结果表明，CD169可以与HIV-1病毒结合，从而促进HIV-1病毒的内化和复制。 第三部分：CD169与TBK1的相互作用及其对病毒出芽的影响。病毒在宿主细胞内完成复制后需要组装和释放。多数包膜病毒的出芽释放依赖于宿主细胞的ESCRT复合体。HIV-1出芽需要ESCRT-Ⅰ、-Ⅲ和Vps4的参与。HIV-1感染细胞后，TBK1与ESCRT-I的组成成分VPS37C结合，使其磷酸化，从而抑制病毒的出芽。VSV病毒感染单核巨噬细胞后，可引起细胞表达CD169，CD169可诱导TBK1降解。有研究表明，HIV-1感染单核细胞后，细胞不表达CD169。那么，诱导细胞表达CD169后，CD169是否可以通过降解TBK1来促进病毒的出芽呢？ 本部分研究主要通过使用病毒感染单核细胞，流式检测细胞表面CD169分子的表达;其他细胞因子和细胞因子IFN-α分别刺激单核细胞，检测细胞表面CD169的表达量;HIV gag-iGFP病毒感染THP-1/IFN-α-THP-1细胞，检测感染结束时上清中HIV p24的表达。 结果显示，HIV-1感染后的THP-1细胞表面CD169分子表达无变化;IFN-α刺激的THP-1细胞中，随着刺激时间的延长，细胞表面CD169的表达增加，TBK1蛋白的表达量呈一定的下降趋势，但是该下降无统计学意义;HIV-1感染的IFN-α-THP-1与THP-1相比，TBK1蛋白的表达量无变化，感染后上清中的病毒无变化。 结果表明，病毒直接感染单核细胞不能引起细胞表面CD169分子的表达，IFN-α可以刺激单核细胞表达CD169分子;CD169分子的表达使得细胞内TBK1蛋白的表达出现一定的下降趋势（无显著差异）;CD169分子不能通过降解TBK1来促进病毒的出芽。

目录

英文缩写词

摘要

前言

第一部分 SIV感染猴外周血CD14+单核细胞CD169分子表达的变化

第一节引言

第二节实验材料

第三节实验方法

第四节实验结果

第五节讨论

第二部分 CD169分子对HIV-1病毒内化作用的研究

第一节引言

第二节实验材料

第三节实验方法

第四节实验结果

第五节讨论

第三部分 CD169与TBK1的相互作用及其对病毒出芽的影响

第一节引言

第二节实验材料

第三节实验方法

第四节实验结果

第五节讨论

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