CD169、CD163和3’非翻译区人工微小RNA对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺巨噬细胞的抑制作用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是我国养猪业中重要的传染病之一，造成了巨大的经济损失。目前防控PRRS的主要手段为疫苗接种，但保护效果欠佳，且活疫苗存在安全隐患。RNA干扰是一种真核细胞固有的转录后基因沉默机制，也是先天性抗病毒机制，目前已发展成为有效的抗病毒感染策略。据报导，基因工程载体表达的人工微小RNA（artificial miRNA，amiRNA）能够作为有效的抗病毒手段，而人和小鼠的外排体(exosome)可以作为微小RNA的传递载体。
　　PRRSV主要感染猪的单核-巨噬细胞系统，特别是猪肺巨噬细胞(porcine alveolarmacrophage，PAM)。参与PAM感染的受体主要有CD163和唾液酸粘附素(sialoadhesin，Sn)或称CD169，前者是起主要作用的核心受体，后者是起次要作用的辅助受体。PRRSV基因组5'和3'非翻译区(untranslated region，UTR)含有高度保守的顺式调控序列，在病毒复制中发挥关键作用。为了研究控制PRRS的新策略，本研究构建了表达CD163、Sn和3'UTR amiRNA的重组腺病毒(recombinant adenovirus，tAd)，并在细胞水平上研究rAd和外排体传导的amiRNA对PRRSV感染或复制的抑制作用。
　　为了研究CD163和Sn特异amiRNA对PRRSV感染的抑制作用，分别将两个amiRNA表达盒插入腺病毒载体，用重组载体转染AAV-293细胞，获得了两株rAd。流式细胞术和荧光显微镜观察结果显示，rAd能有效转导PK-15细胞，感染指数(MOI)为100时的转导效率可达100％;原代PAM细胞的转导效率很低，MOI为800时的转导效率仅达62％。Real-time RT-PCR检测结果显示，rAd转导细胞不仅能有效表达序列特异amiRNA，而且表达的amiRNA能通过外排体分泌到细胞外。Real-time RT-PCR和流式细胞术检测结果显示，rAd表达和外排体传送的amiRNA均能显著抑制CD163和Sn基因转录和蛋白表达，两种方式同时传递amiRNA的抑制作用更强。Real-time RT-PCR和病毒滴定结果显示，两种rAd转导和含两种amiRNA外排体孵育PAM细胞可显著降低PRRSV ORF7拷贝数和病毒滴度，抑制作用可持续96小时，对3株不同毒力PRRSV感染具有相同的抑制效果。这些研究资料表明，rAd是有效的amiRNA表达载体，猪细胞源外排体可作为amiRNA的传送载体，两种方式共同传送的CD163和Sn特异amiRNA对抑制PRRSV感染PAM细胞具有相加作用。
　　为了研究不同细胞源外排体向PAM细胞传送amiRNA的效率，将PRRSV3'UTR特异amiRNA表达盒插入腺病毒载体，用重组载体转染AAV-293细胞，用获得的rAd分别转导猪肾细胞系PK-15、猪肺巨噬细胞系3D4/163、原代猪肾成纤维细胞PFC和子宫内皮细胞PEEC，从转导细胞培养液分离外排体。Real-time RT-PCR检测结果显示，rAd转导的4种猪源细胞不仅能有效表达序列特异amiRNA，而且表达的amiRNA能通过外排体分泌到细胞外，但不同细胞分泌amiRNA的能力有所差异。荧光显微镜观察结果显示，荧光染料标记的外排体能被上述4种类型细胞和原代PAM细胞有效摄取。Real-timeRT-PCR检测结果显示，原代PAM细胞能有效摄取4种细胞源外排体及其amiRNA，并具有时间和剂量依赖性。Real-time RT-PCR和病毒滴定试验结果显示，外排体传送的3'UTR特异amiRNA对不同毒株PRRSV复制具有显著的抑制作用。这些研究结果表明，不同猪源细胞外排体均能向PAM细胞传递amiRNA，外排体传递的3'UTR特异性amiRNA能显著抑制不同毒株PRRSV复制。

目录

摘要

英文缩写表

综述一：猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

1．分类地位和理化特性

2．基因组结构和编码蛋白

2．1．病毒非结构蛋白

2．2．病毒主要囊膜蛋白

2．3．病毒次要囊膜蛋白

2．4．病毒核衣壳蛋白

3．病毒受体

4．免疫应答

综述二：微小RNA及其传递载体

1．miRNA的结构与功能

1．1．结构与表达

1．2．功能

2．miRNA的人工合成与表达

3．miRNA表达载体

3．1．病毒载体

3．2．非病毒性载体

4．总结

研究内容一：重组腺病毒和外排体传送的CD169、CD163人工微小RNA对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抑制作用

1．材料

1．1．细胞、质粒、菌株和毒株

1．2．工具酶和主要试剂

1．3．培养基与溶液

1．4．主要实验设备

2．方法

2．1．重组腺病毒制备和鉴定

2．2．amiRNA表达检测

2．3．外排体制备和检测

2．4．amiRNA抗病毒作用检测

3．结果

3．1．重组腺病毒制备与鉴定

3．2．amiRNA表达与分泌检测

3．3．amiRNA抑制靶基因表达检测

3．4．Sn和CD163 amiRNA的抗病毒作用检测

4．讨论

研究内容二：外排体传递的3'UTR微小RNA对PRRSV复制的抑制作用

1．材料

1．1．细胞，质粒，菌株和毒株

1．2．工具酶和主要试剂

1．3．培养基与溶液

1．4．主要实验设备

2．方法

2．1．细胞的培养

2．2．重组腺病毒制备、感染和amiRNA检测

2．3．外排体分离纯化、western blot和形态学鉴定

2．4．外排体标记、细胞传递和观察

2．5．amiRNA定量检测

2．6．外排体介导的amiRNA抗病毒作用检测

2．7．数据处理

3．结果

3．1．重组腺病毒转导细胞的amiRNA表达

3．2．外排体的鉴定

3．3．外排体介导的amiRNA分泌

3．4．外排体介导的amiRNA传递

3．5．外排体向PAM的amiRNA传递

3．6．外排体传递的amiRNA的抗病毒作用

4．讨论

参考文献

发表论文

致谢

声明