人非小细胞肺癌与艾滋病(HIV--1感染)的靶向治疗手段的筛选、优化及其应用

摘要

目的：人非小细胞肺癌及艾滋病均位于世界上公认的几大疑难病前列。目前化疗仍是非小细胞肺癌治疗最主要的手段之一，然而由于化疗药物无选择性及针对性，在杀伤癌细胞的同时，对人体的正常组织及细胞也有强烈的毒性，往往在发挥治疗作用的同时也会带来极强的毒副作用。艾滋病的治疗中同样也有相似的问题，目前抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的治疗仍然主要依靠“鸡尾酒疗法”，虽然“鸡尾酒疗法”在控制艾滋病的发展进程，提高生命质量方面起了极大的推动作用，长期服药带来的耐受性及依从性差，不能完全治愈HIV-1感染等方面的问题仍然亟待解决。在本文中，针对人非小细胞肺癌和HIV-1感染这两类疑难疾病，通过不同的科学手段，筛选、优化针对其的靶向治疗药物和方法，以期最终应用靶向治疗手段提高患者的生存质量。 方法：一、在人非小细胞肺癌的靶向试剂筛选中，(1)我们直接采用活体荷瘤鼠作为筛选靶标，利用具有高丰度的寡核苷酸序列作为筛选的起始文库，同时突破性地在活体筛选的过程中对核酸文库引入了PEG修饰，在筛选过程中通过克隆测序等手段检测序列的富集程度，逐步优化筛选人非小细胞肺癌核酸适配体;(2)通过细胞结合实验、流式细胞检测、靶细胞与适配体的亲和力测定以及细胞增殖和毒性检测等方法在体外评估筛选的核酸适配体的靶向性、亲和力及其功能;(3)通过活体成像，实时荧光定量PCR，荷瘤鼠体内抑瘤性评估等手段在体内水平鉴定核酸适配体的体内靶向性及抑瘤性。二、在人非小细胞肺癌的靶向治疗手段的开发中，体外合成人非小细胞肺癌靶向的核酸适配体，通过细胞结合实验、流式细胞检测、亲和力测定、细胞增殖检测、活体成像、实时荧光定量PCR等手段对比合成的核酸适配体及转录后核酸适配体的靶向性、亲和力及其功能;利用筛选到的核酸适配体作为载药媒介，形成核酸适配体-表阿霉素复合物，通过体外细胞增殖检测，荷瘤鼠体内移植瘤体积评估等手段检测复合物的抗癌活性。三、在HIV-1感染细胞的靶向性人嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的优化过程中，构建搭载不同共刺激信号区域的CAR-T细胞，通过检测细胞中CAR的表达量、靶向性杀伤作用、细胞的分子表型鉴定等评估新型CAR-T细胞的稳定性和靶向性。 结果：从人非小细胞肺癌靶向试剂的筛选及鉴定中得出：(1)本研究中成功搭建了人非小细胞癌活体-SELEX筛选平台，通过多轮筛选，得到富集度高的可与人非小细胞肺癌NCI-H460特异结合并具有抗癌和靶向作用的双特异性核酸适配体RA16;(2)经细胞水平及分子生物学鉴定，该抗癌和靶向作用的双特异性核酸RNA适配体RA16，能够特异性及高度亲和性的与H460与人非小细胞肺癌细胞、组织结合，其与H460细胞结合的亲和力系数Kd仅为9±2nM;(3)适配体RA16在体内能特异性的富集到荷瘤鼠的肿瘤组织，其在肿瘤组织中的量为其他组织器官中的10～100倍，与起始RNA相比提高了40倍;(4)该适配体RA16的生物学功能鉴定表明RA16能够特异性的抑制人非小细胞肺癌的增殖，在300nM浓度时，其对NCI-H460细胞的抑制作用达75％以上，经测定，其对H460细胞的IC50值为116.7nM，而对于其他细胞几乎无作用，RA16在荷瘤鼠体内活性研究进一步显示其对人非小细胞肺癌实体瘤的抑制率达54.26±5.87％：(5)合成的适配体RA16的体外靶向性及活性鉴定显示，化学合成的适配体RA16在体外仍保持靶向及抑瘤的双特异性，与转录的适配体RA16相比，合成的RA16对NCI-H460细胞的亲和力系数Kd为24.75±2.28nM，IC50仅为118.4nM，活体成像及实时定量PCR也显示了合成的RA16良好的体内靶向性;(6)适配体RA16介导的化疗药物复合物（RA16-表阿霉素复合物）对靶细胞(NCI-H460)的细胞毒性较非靶细胞明显增强，同时，适配体RA16-表阿霉素复合物对荷瘤鼠内移植瘤的抑制率达到了64.32±7.92％，较单一使用化疗药物表阿霉素（45.34±10.82％）的抑制率明显提高。在抗HIV-1感染细胞的靶向CAR-T细胞的优化中：(1)在原始的CD4ζCAR中增加共刺激信号域基本不改变CAR在T细胞中的表达;(2)共刺激信号区域基本不影响CAR-T细胞的增殖和抗HIV-1特异性的细胞毒作用;(3)通过新型的培养体系，可以富集到转染抗HIV-1的CD4ζCAR的干细胞记忆T细胞(Tscm)，CAR中增加共刺激信号区域基本不影响T细胞的分子表型;(4)共刺激信号域在Tscm中能够增强其抗HIV-1的靶向毒性，但是共刺激信号域CD28会影响到CD4ζCAR的稳定性，在后期应用中选用共刺激信号域4-1BB能够更好地维持CD4ζCAR的稳定性和靶向毒性。 结论：本研究探讨了人非小细胞肺癌及HIV-1感染的靶向治疗手段的筛选、优化及应用，其中，所筛选到的RNA适配体对于人非小细胞肺癌具有高度靶向性与亲和性，对于人非小细胞肺癌的靶向治疗与分子诊断具有推动作用。本研究中优化的抗HIV-1感染细胞的人嵌合抗原受体T细胞具有良好的稳定性和靶向细胞毒作用，对于推动免疫疗法杀伤HIV-1感染细胞具有积极意义。

目录

摘要

第一章引言

第二章体内筛选人非小细胞肺癌(NCI-H460)靶向的适配体及其鉴定

一、实验材料

2．1．1细胞系

2．1．2主要器材

2．1．3主要试剂

2．1．4实验动物

2．1．5常规溶液配制

二、实验方法

2．2．1 DNA文库的构建与扩增

2．2．2 RNA文库的制备

2．2．2转录产物的DNase I处理

2．2．3 RNA文库的PEG修饰

2．2．4 RNA适配体的活体筛选

2．2．5反转录与PCR扩增

2．2．6 RNA适配体的重复筛选

2．2．7 RNA文库的克隆测序

2．2．8 RNA适配体的荧光标记

2．2．9荧光显微镜检测RNA适配体的细胞特异性

2．2．10流式细胞术检测适配体的结合特性

2．2．11适配体与靶细胞结合的亲和力测定

2．2．13通过qRT-PCR检测适配体RA16在器官中的分布

2．2．14活体成像跟踪RNA适配体RA16的在荷瘤鼠活体内的分布

2．2．16 RNA适配体RA16对荷瘤鼠肿瘤生长的测定

2．2．17统计学分析

三、实验结果与分析

2．3．1 In Vivo SELEX筛选过程

2．3．2 DNA文库的测序得到富集的适配体RA16

2．3．3适配体RA16能够特异性地与人非小细胞肺癌NCI-H460细胞结合

2．3．4适配体RA16对NCI-H460具有高度亲和力

2．3．6适配体RA16在荷瘤鼠体内高度富集于肿瘤组织

2．3．7适配体RA16特异性地抑制人非小细胞肺癌NCI-H460细胞的生长

2．3．8适配体RA16在荷瘤鼠内抑制肿瘤的生长

四、结论和讨论

第三章人非小细胞肺癌(NCI-H460)靶向适配体的合成及其在靶向传递系统中的应用初探

一、实验材料

二、实验方法

3．2．3荧光显微镜观察适配体-细胞结合能力

3．2．4流式检测及适配体亲和力测定

3．2．6活体成像跟踪RNA适配体RA16的在荷瘤鼠活体内的分布

3．2．8适配体RA16序列的缩减和优化

3．2．9适配体片段与NCI-H460细胞的特异性检测

3．2．13 RA16-EPI在血清中的稳定性测定

3．2．14 PEG化的适配体在血清中的稳定性测定

3．2．15 RA16-EPI在荷瘤鼠体内的抑瘤性测定

3．2．16统计学分析

三、结果与分析

3．3．2合成的RA16保持了RA16 对NCI-H460的高度亲和力

3．3．3合成的RA16特异性地抑制人非小细胞肺癌NCI-H460细胞的生长

3．3．4合成的RA16能在荷瘤鼠体内靶向于NCI-H460肺癌组织

3．3．5缩短的RA16片段S3仍具有NCI-H460细胞结合的特异性

3．3．6 RA16-EPI复合物的形成及其特异性

3．3．7 RA16-EPI复合物能选择性的提高对靶细胞的毒性

3．3．8 RA16-EPI能提高化疗药物在荷瘤鼠内的抑瘤作用

四、结论与讨论

第四章HIV-1感染细胞靶向的人嵌合抗原受体T细胞的优化研究

一、实验材料

2．1．1细胞

2．1．2主要器材

2．1．3主要试剂

2．1．4主要溶液配制

二、实验方法

4．2．1含有共刺激信号域的CD4ζ CAR慢病毒载体的构建

4．2．2慢病毒的制备

4．2．3人Pan T、CD4+T、CD8+T细胞的分离与培养

4．2．4人Na?ve T细胞的分离与培养

4．2．5慢病毒转染T细胞

4．2．7 T细胞的分子表型分析

4．2．8 CAR T细胞的靶向性细胞毒性检测

4．2．9统计学分析

三、结果与分析

4．3．2含有共刺激信号域的CD4ζ CAR-T细胞仍保持了靶向的细胞毒作用

4．3．3通过新型培养体系能够富集到Tscm

4．3．4富集到转染了CD4ζ CAR的Tscm且不影响CD4ζ CAR-Tscm的分子表型

4．3．5信号域CD28影响了CD4ζ CAR稳定性，而4-1BB能维持较高稳定性

4．3．6共刺激信号域能够增强CAR-CD8+Tscm对靶细胞的细胞毒性

四、结论和讨论

参考文献

文献综述 核酸适配体筛选技术及其应用的研究进展

附录

致谢

研究生简历

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