甜杨G6PDH抗冻机制及相关基因克隆

摘要

甜杨(P.suaveolens)是极其抗冻抗旱的高大乔木，其生存区的年平均气温为-3.8℃，极端最低气温为-46.9℃，冬季气温为-27.4℃～-40.5℃，年平均降雨量为493.4mm，无霜期仅为93天。因此，甜杨是一种研究木本植物抗冻机制及相关抗冻基因克隆的理想材料。G6PDH是PPP途径的关键性调控酶，其主要功能是催化葡萄糖-6-磷酸氧化反应，所产生的某些中间产物(RU5P和E4P等)以及产生NADPH可为蛋白质、脂肪酸、氨基酸、固醇类等重要物质的生物合成提供各种反应底物和还原力，同时还涉及到多种环境胁迫而引起的植物应答反应。但至今未见有关木本植物G6PDH抗冻机制研究以及相关基因的克隆等方面的成功报道。 本研究以甜杨幼苗为试材，以G6PDH活性变化与抗冻性的关系为主线，以细胞抗冻性和膜稳定性相关的各种生理生化指标的测定为依据，研究了在-20℃低温锻炼过程中幼苗体内的NADPH、NADH、H2O2和MDA含量以及半致死温度LT50，抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途径及糖酵解途径的关键性调控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶(APX、DHAR、MDAR和GR)活性以及抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量和蛋白质含量的具体变化，从中探讨G6PDH在低温诱导甜杨幼苗抗冻性提高的可能作用，进而阐明甜杨抗冻性的可能机制。另一方面，在G6PDH分离纯化的前提下，研究了还原型二硫苏糖醇(DTTred)、pH值、代谢物及金属离子对G6PDH活性的影响，并对该酶催化反应特性进行分析。在此基础上，根据已有的拟南芥(Arabidopsisthaliana)和马铃薯(Solanumtuberosum)等植物的G6PDH基因的保守区域序列设计引物，以甜杨的总RNA为模板，通过RT-PCR或RACE法钓取目的基因等克隆技术分离并确定与抗冻性相关的G6PDH基因，并对其核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析。通过上述研究可得到以下主要结果： 1.以甜杨G6PDH活性变化与抗冻性的关系为主线，以细胞抗冻性和膜稳定性相关的各种生理生化指标的测定为依据，对在-20℃低温锻炼及脱锻炼过程中幼苗体内的NADPH、NADH、H2O2和MDA含量，半致死温度LT50，抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途径及糖酵解途径的关键性调控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶(APX、DHAR、MDAR和GR)活性以及抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量和蛋白质含量的动态变化进行了系统研究，并对上述各理化指标间的内在联系，以及它们与G6PDH活性变化及抗冻性的相关性进行分析，这在国内外上尚未报道。实验结果表明，低温锻炼所引起的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性、抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶(APX、DHAR、MDAR和GR)活性、抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量以及蛋白质含量的变化与G6PDH活性变化密切相关，而且这些指标的变化与幼苗MDA含量、H2O2含量以及半致死温度LT50的降低密切相关。由此可认为G6PDH可能参与了甜杨幼苗抗氧化酶活性及抗坏血酸-谷胱甘肽循环运转能力的调节、抗氧化剂和膜结构稳定性相关物质的合成以及抗冻性的低温诱导，是甜杨抵御冰冻低温的一种重要生理物质。 2.为了探讨低温锻炼对不同糖代谢途径的影响效应，对在低温锻炼和脱锻炼中的G6PDH和PFK活性以及NADPH和NADH含量的变化进行比较分析，结果发现，在-20℃低温锻炼中，幼苗枝条内的NADH含量的增加幅度以及PFK活性的提高程度分别不如NADPH含量和G6PDH活性明显，但脱锻炼所引起的下降程度却分别比NADPH含量和G6PDH活性显著。这说明低温锻炼对酵解途径的影响效应相对较小，反映出不同糖代谢途径对低温胁迫应答具有一定的差异。据此可认为，低温锻炼可能引起了体内糖代谢途径的改变与能量的适应性变化，而甜杨幼苗在低温下可能主要是通过PPP途径来产生高水平的NADPH，才能满足与抗冻性发育有关的RNA、蛋白质等生物合成的需要。 3.细胞抗氧化能力与抗冻性关系的研究结果表明，低温锻炼所引起的SOD、POD和CAT活性提高的幅度均小于APX、DHAR、MDAR和GR、而且也小于抗氧化剂ASA、DHA、GSH和GSSG含量的增加幅度；另外，脱锻炼2d后，经低温锻炼的幼苗其体内APX、DHAR、MDAR、GR、ASA、DHA、GSH和GSSG下降幅度均小于SOD、POD和CAT，而且APX、DHAR、MDAR和GR活性以及ASA、DHA、GSH和GSSG含量仍高于未锻炼幼苗水平。由此可见，不同抗氧化酶在细胞内清除H2O2的过程中所起的作用存在着一定的差异，在低温胁迫下甜杨幼苗内H2O2的清除主要是通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环来实现的。这也在一定程度上反映出低温锻炼的幼苗在脱锻炼后还能保持较高的抗坏血酸-谷胱甘肽循环能力和清除H2O2能力，可能与维持脱锻炼后幼苗恢复正常生长的需要有关。 4.首次以从-20℃低温锻炼的甜杨幼苗中分离纯化的G6PDH为研究对象，研究了还原型二硫苏糖醇(DTTred)、pH值、代谢物及金属离子对G6PDH活性的影响，并对该酶催化反应特性进行分析。结果发现，所分离纯化的G6PDH定位于细胞质、其最适反应pH值为8.2，而且NADPH、NADH、GTP、UTP、ATP、AMP、ADP、CoA、AcetylCoA、F6P、E4P、R5P和3-PG处理对该酶活性均有不同程度抑制，其中NADPH抑制作用较强；Mg2+、Ca2+和K+对该酶活性没有影响，而Cd2+对该酶活性有较强的抑制作用。另外，该酶的最大反应速度为68U/mgprotein，底物G6P和NADP的米氏常数(Km)分别为360μmol/L和16μmol/L，表明甜杨细胞质的G6PDH活性高于已报道的其他植物材料的G6PDH活性。 5.根据已有的拟南芥、烟草和马铃薯的G6PDH基因的保守区域序列设计引物，利用RT-PCR技术成功地从甜杨总RNA中扩增出长度为1200bp的G6PDH基因，可编码367个氨基酸，这是国内外首次获得木本植物G6PDH基因。该基因片段命名为PsG6PDH，现己在Genbank上登记(Y445917)。同源性分析发现，甜杨PsG6PDH基因序列与马铃薯、烟草和紫色苜蓿的细胞质的G6PDH基因序列具有较高同源性，但与马铃薯质体的G6PDH基因序列的同源性较低。进一步分析发现，所编码的氨基酸序列与小麦、马铃薯、烟草、水稻和拟南芥的细胞质的G6PDH基因编码氨基酸序列的一致率也相对较低，而且基因长度及其编码的氨基酸数目均明显短于水稻、小麦、马铃薯、烟草和拟南芥等植物，但具有与水稻、小麦、马铃薯、烟草和拟南芥等植物完全一致的NADP结合位置NEFVIRLQP结构以及底物G6P结合位置的IDHYLG序列。据此可认为，本实验所克隆的甜杨PsG6PDH编码的G6PDH可能为细胞质的G6PDH，而且其编码的氨基酸与小麦、烟草、马铃薯、水稻和拟南芥等在生理功能上存在一定差异。同时，也在一定程度上暗示了高大乔木甜杨的G6PDH基因可能有别于其它草本植物的G6PDH基因。 6.氨基酸组分分析结果表明，在甜杨PsG6PDH基因所编码的367个中，亲水性氨基酸约占总氨基酸的52.9％，其中碱性氨基酸占13.1％，酸性氨基酸占11.9％，这与小麦、拟南芥等植物低温诱导基因表达的抗冻蛋白的氨基酸比例具有一定的相似性，说明甜杨G6PDH类似于抗冻蛋白具有较高的亲水性。由此可推测，PsG6PDH基因可能是一种与抗冻性有关的基因。

目录

摘要

主要缩写词

1文献综述

2甜杨G6PDH特性及抗冻机制研究

3甜杨G6PDH基因的克隆及序列分析

4结论

参考文献

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致谢